Chromosomenkämmen - Chromosome combing

Das Chromosomenkämmen (auch als molekulares Kämmen oder DNA-Kämmen bekannt) ist eine Technik, die verwendet wird, um eine Anordnung gleichmäßig gestreckter DNA herzustellen , die dann für Nukleinsäurehybridisierungsstudien wie fluoreszierende In-situ-Hybridisierung (FISH), die von der Gleichmäßigkeit des Streckens profitieren, sehr gut geeignet ist , der einfache Zugang zu den Hybridisierungszielsequenzen und die Auflösung, die der große Abstand zwischen zwei Sonden bietet, der auf die Dehnung der DNA um den Faktor 1,5-fache der kristallographischen Länge der DNA zurückzuführen ist.

DNA in Lösung (dh mit einer zufällig gewickelten Struktur) wird gestreckt, indem der Meniskus der Lösung mit einer konstanten Geschwindigkeit (typischerweise 300 um / s) zurückgezogen wird. Die Enden von DNA-Strängen, von denen angenommen wird, dass sie ausgefranst sind (dh offene und freiliegende polare Gruppen), binden an ionisierbare Gruppen, die eine silanisierte Glasplatte bei einem pH-Wert unter dem pKa der ionisierbaren Gruppen beschichten (um sicherzustellen, dass sie ausreichend geladen sind, um mit den Enden zu interagieren von DNA). Der Rest der DNA, bei der es sich hauptsächlich um dsDNA handelt, kann diese Wechselwirkungen nicht bilden (abgesehen von einigen "Aufsetz" -Segmenten entlang der Länge des DNA-Strangs) und steht daher für die Hybridisierung mit Sonden zur Verfügung. Wenn sich der Meniskus zurückzieht, erzeugt die Oberflächenretention eine Kraft, die auf die DNA wirkt, um sie in der flüssigen Phase zu halten. Diese Kraft ist jedoch der Stärke der DNA-Bindung unterlegen. das Ergebnis ist, dass die DNA beim Eintritt in die Luftphase gedehnt wird; Da die Kraft an der Stelle der Luft / Flüssig-Phase wirkt, ist sie für unterschiedliche Längen oder Konformationen der DNA in Lösung unveränderlich, sodass DNA beliebiger Länge genauso gedehnt wird, wie sich der Meniskus zurückzieht. Da diese Dehnung entlang der Länge einer DNA konstant ist, kann der Abstand entlang des Strangs mit dem Basengehalt in Beziehung gesetzt werden. 1 um entspricht ungefähr 2 kb.

DNA-Regionen von Interesse werden beobachtet, indem sie mit Sonden hybridisiert werden, die mit Haptenen wie Biotin markiert sind ; Dies kann dann durch eine oder mehrere Schichten von Fluorochrom-assoziierten Liganden (wie Immunfluoreszenz-Antikörpern) gebunden werden. Eine mehrfarbige Kennzeichnung ist ebenfalls möglich. Dies hat mehrere Verwendungsmöglichkeiten, typischerweise als hochauflösende physikalische Kartierungstechnik (z. B. zum Positionsklonen), ein Beispiel dafür war die korrekte Kartierung von 200 kb der CAPN3-Genregion oder die Kartierung nicht überlappender Sequenzen (seit dem Abstand zwischen zwei Sonden kann genau gemessen werden). Es ist daher nützlich, um Exons, Mikrodeletionen, Amplifikationen oder Umlagerungen zu finden. Vor der Verbesserung des Kämmens war FISH zu niedrig aufgelöst, um in diesem Fall von Nutzen zu sein. Bei dieser Technik ist die Auflösung von FISH theoretisch nur durch die Auflösung des Epifluoreszenzmikroskops begrenzt ; In der Praxis werden Auflösungen von etwa 2 µm für DNA-Moleküle erhalten, die normalerweise 200 bis 600 kb lang sind (obwohl Combing-FISH mit einigem Erfolg bei Molekülen mit einer Länge von mehr als 1 Mb eingesetzt wurde), und es kann Raum für Verbesserungen durch Optimierung geben . Da es sich bei DNA-Analysen mit dieser Technik um Einzelmoleküle handelt, können Genome aus verschiedenen Zellen verglichen werden, um Anomalien zu finden, die Auswirkungen auf die Diagnose von Krebs und andere genetische Veränderungen haben.

Das Chromosomenkämmen wird auch verwendet, um die DNA-Replikation zu untersuchen , ein stark regulierter Prozess, der auf einem spezifischen Programm der zeitlichen und räumlichen Verteilung der Aktivierung von Replikationsursprüngen beruht . Jeder Ursprung hat einen bestimmten genetischen Ort und darf nur einmal pro Zellzyklus ausgelöst werden . Das Kämmen von Chromosomen ermöglicht eine genomweite Ansicht des Brennens von Ursprüngen und der Ausbreitung von Replikationsgabeln . Da keine Annahmen über die Sequenz der Ursprünge gemacht werden, ist diese Technik besonders nützlich für die Kartierung von Ursprüngen in Eukaryoten , von denen nicht angenommen wird, dass sie genau definierte Initiationssequenzen haben.

Strategien, bei denen kürzlich replizierte DNA gekämmt wird, umfassen typischerweise den Einbau modifizierter Nukleotide (wie BrdU, Bromdeoxyuridin ) in die entstehende DNA und den anschließenden fluoreszierenden Nachweis. Wenn sich Replikationsgabeln bidirektional von Replikationsursprüngen mit (ungefähr) gleichen Geschwindigkeiten ausbreiten, kann auf die Ursprungsposition geschlossen werden. Das Ersetzen des modifizierten Nukleotidpools durch einen anderen Typ eines modifizierten Nukleotids nach einer bestimmten Zeit ermöglicht die Entwicklung eines zeitaufgelösten Bildes des Brennens von Stellen und der Kinetik von Replikationsgabeln. Pausenstellen können identifiziert, zusammengeführte Replikationsgabeln aufgelöst und die Häufigkeit von Ursprungszündungen in verschiedenen zu untersuchenden Zeiträumen ermittelt werden.

In-vitro- Studien mit Xenopus laevis- Eiextrakt haben gezeigt, dass die Brennhäufigkeit mit fortschreitender S-Phase zunimmt. In einer anderen Studie zu Epstein-Barr-Virus- Episomen wurden hybridisierte Sonden verwendet, um die regionale Verteilung von Feuerereignissen zu visualisieren. Eine bestimmte Zone bevorzugte das Brennen, während auch einige Pausenstellen abgeleitet wurden.

Das Chromosomenkämmen wird von der in Paris ansässigen Firma Genomic Vision durchgeführt.