Edman Degradation - Edman degradation

Der von Pehr Edman entwickelte Edman-Abbau ist eine Methode zur Sequenzierung von Aminosäuren in einem Peptid . Bei diesem Verfahren wird der aminoterminale Rest markiert und vom Peptid abgespalten, ohne die Peptidbindungen zwischen anderen Aminosäureresten zu stören .

Mechanismus

Edman-Abbau mit generischer Aminosäurepeptidkette

Phenylisothiocyanat wird mit einer ungeladenen N-terminalen Aminogruppe unter leicht alkalischen Bedingungen umgesetzt, um ein cyclisches Phenylthiocarbamoylderivat zu bilden . Dann wird dieses Derivat der terminalen Aminosäure unter sauren Bedingungen als Thiazolinonderivat gespalten. Die Thiazolinonaminosäure wird dann selektiv in ein organisches Lösungsmittel extrahiert und mit Säure behandelt, um das stabilere Phenylthiohydantoin (PTH) - Aminosäurederivat zu bilden, das mittels Chromatographie oder Elektrophorese identifiziert werden kann . Dieser Vorgang kann dann erneut wiederholt werden, um die nächste Aminosäure zu identifizieren. Ein Hauptnachteil dieser Technik besteht darin, dass die auf diese Weise sequenzierten Peptide nicht mehr als 50 bis 60 Reste aufweisen können (und in der Praxis unter 30). Die Peptidlänge ist begrenzt, da die zyklische Derivatisierung nicht immer vollständig verläuft. Das Derivatisierungsproblem kann gelöst werden, indem große Peptide in kleinere Peptide gespalten werden, bevor mit der Reaktion fortgefahren wird. Mit modernen Maschinen mit einer Effizienz von über 99% pro Aminosäure können bis zu 30 Aminosäuren genau sequenziert werden . Ein Vorteil des Edman - Abbaus ist , dass es verwendet nur 10 bis 100 pico-Mol des Peptid für die Sequenzierung. Die Edman-Abbaureaktion wurde 1967 von Edman und Beggs automatisiert, um den Prozess zu beschleunigen, und bis 1973 waren weltweit 100 automatisierte Geräte im Einsatz.

Einschränkungen

Da der Edman-Abbau vom N-Terminus des Proteins ausgeht, funktioniert er nicht, wenn der N-Terminus chemisch modifiziert wurde (z. B. durch Acetylierung oder Bildung von Pyroglutaminsäure ). Die Sequenzierung stoppt, wenn eine Nicht-α-Aminosäure (z. B. Isoasparaginsäure ) angetroffen wird , da das bevorzugte fünfgliedrige Ringzwischenprodukt nicht gebildet werden kann. Der Edman-Abbau ist im Allgemeinen nicht nützlich, um die Positionen von Disulfidbrücken zu bestimmen. Es erfordert auch Peptidmengen von 1 Picomol oder mehr für erkennbare Ergebnisse.

Gekoppelte Analyse

Nach der 2D-SDS-PAGE können die Proteine ​​zur weiteren Analyse auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF) -Blotmembran übertragen werden. Edman-Abbau kann direkt von einer PVDF-Membran durchgeführt werden. Die Sequenzierung von N-terminalen Resten, die zu fünf bis zehn Aminosäuren führt, kann ausreichen, um ein Protein von Interesse (POI) zu identifizieren.

Siehe auch

Verweise