Fluoreszenz- in-situ- Hybridisierung -Fluorescence in situ hybridization

Multiplex-RNA-Visualisierung in Zellen mit ViewRNA FISH-Assays
Eine Metaphase-Zelle, die für die bcr/abl- Umlagerung (assoziiert mit chronischer myeloischer Leukämie ) positiv ist, unter Verwendung von FISH. Die Chromosomen sind in Blau zu sehen. Das Chromosom, das mit grünen und roten Punkten (oben links) markiert ist, ist dasjenige, bei dem die Umlagerung vorhanden ist.

Fluoreszenz in situ Hybridisierung ( FISH ) eine molekulare zytogenetische Technik , die verwendeten Fluoreszenzsonden , die binden , um nur bestimmte Teile einer Nukleinsäuresequenz mit einem hohen Grad an Sequenz Komplementarität . Es wurde in den frühen 1980er Jahren von biomedizinischen Forschern entwickelt, um das Vorhandensein oder Fehlen spezifischer DNA- Sequenzen auf Chromosomen nachzuweisen und zu lokalisieren . Fluoreszenzmikroskopie kann verwendet werden, um herauszufinden, wo die Fluoreszenzsonde an die Chromosomen gebunden ist. FISH wird häufig verwendet, um spezifische Merkmale in der DNA für die genetische Beratung , Medizin und Artenbestimmung zu finden. FISH kann auch verwendet werden, um spezifische RNA-Targets ( mRNA , lncRNA und miRNA ) in Zellen, zirkulierenden Tumorzellen und Gewebeproben zu erkennen und zu lokalisieren . In diesem Zusammenhang kann es helfen, die räumlich-zeitlichen Muster der Genexpression in Zellen und Geweben zu definieren.

Sonden – RNA und DNA

ViewRNA-Nachweis von miR-133(grün) und Myogenin-mRNA (rot) in C2C12-differenzierenden Zellen

In der Biologie ist eine Sonde ein DNA- oder RNA-Einzelstrang, der zu einer interessierenden Nukleotidsequenz komplementär ist.

RNA-Sonden können für jedes Gen oder jede beliebige Sequenz innerhalb eines Gens zur Visualisierung von mRNA , lncRNA und miRNA in Geweben und Zellen entworfen werden. FISH wird verwendet, indem der zelluläre Reproduktionszyklus, insbesondere die Interphase der Kerne, auf Chromosomenanomalien untersucht wird. FISH ermöglicht die Analyse einer großen Reihe von Archivfällen viel einfacher, um das genaue Chromosom zu identifizieren, indem eine Sonde mit einer künstlichen chromosomalen Grundlage erstellt wird, die ähnliche Chromosomen anzieht. Die Hybridisierungssignale für jede Sonde, wenn eine Nukleinsäureanomalie nachgewiesen wird. Jede Sonde zum Nachweis von mRNA und lncRNA besteht aus ~20–50 Oligonukleotidpaaren, wobei jedes Paar einen Raum von 40–50 bp abdeckt. Die Besonderheiten hängen von der verwendeten spezifischen FISH-Technik ab. Für den miRNA-Nachweis verwenden die Sonden eine proprietäre Chemie zum spezifischen Nachweis von miRNA und decken die gesamte miRNA-Sequenz ab.

Mit vier verschiedenen Sonden markierte Urothelzellen

Sonden werden oft von DNA-Fragmenten abgeleitet, die zur Verwendung im Humangenomprojekt isoliert, gereinigt und amplifiziert wurden . Die Größe des menschlichen Genoms ist im Vergleich zu der Länge, die direkt sequenziert werden konnte, so groß, dass es notwendig war, das Genom in Fragmente aufzuteilen. (Bei der abschließenden Analyse wurden diese Fragmente geordnet, indem eine Kopie jedes Fragments unter Verwendung sequenzspezifischer Endonukleasen in noch kleinere Fragmente verdaut, die Größe jedes kleinen Fragments unter Verwendung von Größenausschlusschromatographie gemessen und diese Informationen verwendet wurden, um zu bestimmen, wo die große Fragmente überlappten sich.) Um die Fragmente mit ihren individuellen DNA-Sequenzen zu erhalten, wurden die Fragmente in ein System sich kontinuierlich replizierender Bakterienpopulationen eingefügt. Klonische Bakterienpopulationen, wobei jede Population ein einziges künstliches Chromosom besitzt, werden in verschiedenen Labors auf der ganzen Welt gelagert. Die künstlichen Chromosomen ( BAC ) können in jedem Labor mit einer Bibliothek gezüchtet, extrahiert und markiert werden. Genomische Bibliotheken werden oft nach der Institution benannt, in der sie entwickelt wurden. Ein Beispiel ist die RPCI-11-Bibliothek, die nach dem Roswell Park Comprehensive Cancer Center (früher bekannt als Roswell Park Cancer Institute) in Buffalo, New York, benannt ist . Diese Fragmente liegen in der Größenordnung von 100.000 Basenpaaren und sind die Basis für die meisten FISH-Sonden.

Vorbereitungs- und Hybridisierungsprozess – RNA

Zellen, zirkulierende Tumorzellen (CTCs) oder formalinfixierte Paraffin-eingebettet (FFPE) oder gefrorene Gewebeschnitte werden fixiert und dann permeabilisiert, um den Zugang zum Ziel zu ermöglichen. FISH wurde auch erfolgreich an unfixierten Zellen durchgeführt. Eine zielspezifische Sonde, die aus 20 Oligonukleotidpaaren besteht, hybridisiert an die Ziel-RNA(s). Separate, aber kompatible Signalverstärkungssysteme ermöglichen den Multiplex-Assay (bis zu zwei Targets pro Assay). Die Signalverstärkung wird über eine Reihe von sequentiellen Hybridisierungsschritten erreicht. Am Ende des Assays werden die Gewebeproben unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht.

Vorbereitungs- und Hybridisierungsprozess – DNA

Prinzipschema des FISH-Experiments zur Lokalisierung eines Gens im Zellkern.

Zuerst wird eine Sonde konstruiert. Die Sonde muss groß genug sein, um spezifisch mit ihrem Ziel zu hybridisieren, aber nicht so groß, dass sie den Hybridisierungsprozess behindert. Die Sonde wird direkt mit Fluorophoren , mit Targets für Antikörper oder mit Biotin markiert . Die Markierung kann auf verschiedene Weise erfolgen, wie zum Beispiel durch Nick-Translation oder Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von markierten Nukleotiden .

Dann wird eine Interphase- oder Metaphase- Chromosomenpräparation hergestellt. Die Chromosomen sind fest mit einem Substrat , meist Glas, verbunden. Repetitive DNA-Sequenzen müssen durch Hinzufügen kurzer DNA-Fragmente zur Probe blockiert werden. Die Sonde wird dann auf die Chromosomen-DNA aufgebracht und während der Hybridisierung ungefähr 12 Stunden lang inkubiert. Mehrere Waschschritte entfernen alle unhybridisierten oder teilweise hybridisierten Sonden. Die Ergebnisse werden dann mit einem Mikroskop, das den Farbstoff anregen und Bilder aufnehmen kann, visualisiert und quantifiziert.

Bei schwachem Fluoreszenzsignal kann eine Verstärkung des Signals erforderlich sein, um die Nachweisschwelle des Mikroskops zu überschreiten . Die Stärke des Fluoreszenzsignals hängt von vielen Faktoren ab, wie der Effizienz der Sondenmarkierung, dem Sondentyp und dem Farbstofftyp. An das Farbstoffmolekül sind fluoreszierend markierte Antikörper oder Streptavidin gebunden. Diese Nebenkomponenten sind so ausgewählt, dass sie ein starkes Signal haben.

Variationen von Sonden und Analyse

FISH ist eine sehr allgemeine Technik. Die Unterschiede zwischen den verschiedenen FISH-Techniken sind normalerweise auf Variationen in der Sequenz und Markierung der Sonden zurückzuführen; und wie sie in Kombination verwendet werden. Sonden werden in zwei generische Kategorien unterteilt: zellulär und azellulär. Bei der Fluoreszenz-"in situ"-Hybridisierung bezieht sich die zelluläre Platzierung der Sonde

Die Sondengröße ist wichtig, da längere Sonden weniger spezifisch hybridisieren als kürzere Sonden, so dass häufig kurze DNA- oder RNA-Stränge (oft 10–25 Nukleotide), die zu einer bestimmten Zielsequenz komplementär sind, verwendet werden, um ein Ziel zu lokalisieren. Die Überlappung definiert die Auflösung der erkennbaren Merkmale. Wenn zum Beispiel das Ziel eines Experiments darin besteht, den Bruchpunkt einer Translokation zu erkennen , dann definiert die Überlappung der Sonden – der Grad, in dem eine DNA-Sequenz in den benachbarten Sonden enthalten ist – das minimale Fenster, in dem der Bruchpunkt nachgewiesen werden kann .

Die Mischung von Sondensequenzen bestimmt die Art des Merkmals, das die Sonde erkennen kann. Sonden, die entlang eines ganzen Chromosoms hybridisieren, werden verwendet, um die Nummer eines bestimmten Chromosoms zu zählen, Translokationen anzuzeigen oder extrachromosomale Chromatinfragmente zu identifizieren . Dies wird oft als "Ganzchromosomenmalerei" bezeichnet. Wenn jede mögliche Sonde verwendet wird, würde jedes Chromosom (das gesamte Genom) fluoreszierend markiert, was für die Bestimmung von Merkmalen einzelner Sequenzen nicht besonders nützlich wäre. Es ist jedoch möglich, eine Mischung kleinerer Sonden zu erzeugen, die für eine bestimmte Region (Locus) der DNA spezifisch sind; diese Mischungen werden verwendet, um Deletionsmutationen nachzuweisen . In Kombination mit einer bestimmten Farbe wird ein Locus-spezifisches Sondengemisch verwendet, um sehr spezifische Translokationen nachzuweisen. Spezielle Locus-spezifische Sondenmischungen werden oft verwendet, um Chromosomen zu zählen, indem sie an die zentromeren Regionen der Chromosomen binden , die charakteristisch genug sind, um jedes Chromosom (mit Ausnahme von Chromosom 13 , 14 , 21 , 22 ) zu identifizieren .

Eine Vielzahl anderer Techniken verwendet Mischungen unterschiedlich gefärbter Sonden. Eine Reihe von Farben in Mischungen von Fluoreszenzfarbstoffen kann nachgewiesen werden, sodass jedes menschliche Chromosom durch eine charakteristische Farbe unter Verwendung von Gesamtchromosomen-Sondenmischungen und einer Vielzahl von Farbverhältnissen identifiziert werden kann. Obwohl es mehr Chromosomen als leicht unterscheidbare Fluoreszenzfarbstoffe gibt, können Verhältnisse von Sondenmischungen verwendet werden, um Sekundärfarben zu erzeugen. Ähnlich wie bei der vergleichenden genomischen Hybridisierung wird die Sondenmischung für die Sekundärfarben durch Mischen des richtigen Verhältnisses von zwei Sätzen unterschiedlich gefärbter Sonden für dasselbe Chromosom erzeugt. Diese Technik wird manchmal als M-FISH bezeichnet.

Dieselbe Physik, die eine Vielzahl von Farben für M-FISH ermöglicht, kann für die Erkennung von Translokationen verwendet werden. Das heißt, benachbarte Farben scheinen sich zu überlappen; eine Sekundärfarbe wird beobachtet. Einige Assays sind so konzipiert, dass die Sekundärfarbe in interessierenden Fällen vorhanden ist oder fehlt. Ein Beispiel ist der Nachweis von BCR/ABL- Translokationen, bei denen die Sekundärfarbe eine Krankheit anzeigt. Diese Variante wird oft als Doppelfusions-FISH oder D-FISH bezeichnet. In der umgekehrten Situation – wo das Fehlen der Sekundärfarbe pathologisch ist – wird durch einen Assay veranschaulicht, der verwendet wird, um Translokationen zu untersuchen, bei denen nur einer der Bruchpunkte bekannt oder konstant ist. Locus-spezifische Sonden werden für eine Seite des Breakpoints und das andere intakte Chromosom hergestellt. In normalen Zellen wird die Sekundärfarbe beobachtet, aber nur die Primärfarben werden beobachtet, wenn die Translokation auftritt. Diese Technik wird manchmal als "Break-Apart-FISH" bezeichnet.

Einzelmolekül-RNA FISH

Einzelmolekül-RNA-FISH, auch bekannt als Stellaris® RNA-FISH, ist eine Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von mRNA und anderen langen RNA-Molekülen in einer dünnen Schicht einer Gewebeprobe. Durch die Anwendung mehrerer kurzer, einzeln markierter Oligonukleotidsonden können Targets zuverlässig abgebildet werden . Die Bindung von bis zu 48 fluoreszenzmarkierten Oligos an ein einzelnes mRNA-Molekül liefert ausreichend Fluoreszenz, um jede Ziel-mRNA in einem Weitfeld- Fluoreszenzmikroskopiebild genau zu erkennen und zu lokalisieren . Sonden, die nicht an die beabsichtigte Sequenz binden, erreichen keine ausreichende lokalisierte Fluoreszenz, um vom Hintergrund unterschieden zu werden .

Einzelmolekül-RNA-FISH-Assays können im Simplex- oder Multiplex- Verfahren durchgeführt werden und können als Folgeexperiment zur quantitativen PCR verwendet oder gleichzeitig mit einem Fluoreszenz-Antikörper- Assay abgebildet werden. Die Technologie hat potenzielle Anwendungen in der Krebsdiagnose , in den Neurowissenschaften , in der Genexpressionsanalyse und in der Begleitdiagnostik .

Faser FISCH

In einer alternativen Technik zu Interphase- oder Metaphase-Präparaten, Faser-FISH, werden Interphase-Chromosomen so auf einem Objektträger befestigt, dass sie in einer geraden Linie gestreckt sind, anstatt wie beim herkömmlichen FISH eng gewickelt zu sein oder ein Chromosomengebiet einzunehmen Konformation, wie beim Interphase-FISH. Dies wird erreicht, indem entlang der Länge des Objektträgers eine mechanische Scherung angewendet wird, entweder auf Zellen, die auf dem Objektträger fixiert und dann lysiert wurden , oder auf eine Lösung von gereinigter DNA. Zu diesem Zweck wird zunehmend eine Technik verwendet, die als Chromosomenkämmen bekannt ist. Die erweiterte Konformation der Chromosomen ermöglicht eine dramatisch höhere Auflösung – sogar bis hinunter zu einigen Kilobasen . Die Herstellung von Faser-FISH-Proben ist, obwohl konzeptionell einfach, eine ziemlich erfahrene Kunst, und nur spezialisierte Labors verwenden diese Technik routinemäßig.

Q-FISCH

Q-FISH kombiniert FISH mit PNAs und Computersoftware, um die Fluoreszenzintensität zu quantifizieren. Diese Technik wird routinemäßig in der Telomerlängenforschung eingesetzt.

Flow-FISCH

Flow-FISH verwendet Durchflusszytometrie zur automatischen Durchführung von FISH unter Verwendung von Fluoreszenzmessungen pro Zelle.

MA-FISH

Microfluidics-assisted FISH ( MA-FISH ) verwendet einen mikrofluidischen Fluss, um die Effizienz der DNA-Hybridisierung zu erhöhen, den teuren FISH-Sondenverbrauch zu senken und die Hybridisierungszeit zu verkürzen. MA-FISH wird zum Nachweis des HER2- Gens in Brustkrebsgeweben eingesetzt.

MAR-FISH

Mikroautoradiographie FISH ist eine Technik, um radioaktiv markierte Substrate mit konventionellem FISH zu kombinieren, um gleichzeitig phylogenetische Gruppen und metabolische Aktivitäten zu erkennen.

Hybrid Fusion-FISH

Hybrid Fusion FISH ( HF-FISH ) verwendet eine primäre additive Anregungs-/Emissionskombination von Fluorophoren, um zusätzliche Spektren durch einen Markierungsprozess zu erzeugen, der als dynamische optische Transmission (DOT) bekannt ist. Drei primäre Fluorophore sind in der Lage, durch kombinatorische Markierung mit DOT insgesamt 7 gut nachweisbare Emissionsspektren zu erzeugen. Hybrid Fusion FISH ermöglicht hoch gemultiplexte FISH-Anwendungen, die auf klinische Onkologie-Panels ausgerichtet sind. Die Technologie bietet eine schnellere Bewertung mit effizienten Sondensätzen, die mit herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopen leicht nachgewiesen werden können.

Medizinische Anwendungen

Oft möchten Eltern von Kindern mit einer Entwicklungsstörung mehr über den Zustand ihres Kindes wissen, bevor sie sich für ein weiteres Kind entscheiden. Diesen Bedenken kann durch eine Analyse der DNA der Eltern und des Kindes Rechnung getragen werden. In Fällen, in denen die Entwicklungsstörung des Kindes nicht verstanden wird, kann die Ursache möglicherweise mithilfe von FISH und zytogenetischen Techniken bestimmt werden. Beispiele für Krankheiten, die mit FISH diagnostiziert werden, sind Prader-Willi-Syndrom , Angelman-Syndrom , 22q13-Deletionssyndrom , chronische myeloische Leukämie , akute lymphatische Leukämie , Cri-du-chat , Velokardiofaziales Syndrom und Down-Syndrom . FISH auf Samenzellen ist für Männer mit einem abnormalen somatischen oder meiotischen Karyotyp sowie für solche mit Oligozoospermie indiziert , da etwa 50% der oligozoospermischen Männer eine erhöhte Rate an Chromosomenanomalien der Spermien aufweisen. Die Analyse der Chromosomen 21, X und Y reicht aus, um gefährdete oligozoospermische Individuen zu identifizieren.

In der Medizin kann FISH verwendet werden, um eine Diagnose zu stellen , die Prognose zu bewerten oder die Remission einer Krankheit wie Krebs zu beurteilen . Die Behandlung kann dann gezielt angepasst werden. Eine traditionelle Untersuchung mit Metaphase-Chromosomenanalyse ist aufgrund subtiler chromosomaler Merkmale oft nicht in der Lage, Merkmale zu identifizieren, die eine Krankheit von einer anderen unterscheiden; FISH kann diese Unterschiede aufklären. FISH kann auch verwendet werden, um erkrankte Zellen leichter zu erkennen als zytogenetische Standardmethoden , die sich teilende Zellen erfordern und eine arbeits- und zeitintensive manuelle Vorbereitung und Analyse der Objektträger durch einen Techniker erfordern. FISH hingegen benötigt keine lebenden Zellen und kann automatisch quantifiziert werden, ein Computer zählt die vorhandenen fluoreszierenden Punkte. Es ist jedoch ein geschulter Technologe erforderlich, um feine Unterschiede in den Streifenmustern auf gebogenen und verdrehten Metaphasechromosomen zu unterscheiden. FISH kann in ein mikrofluidisches Lab-on-a-Chip- Gerät integriert werden. Diese Technologie befindet sich noch in der Entwicklungsphase, kann aber wie andere Lab-on-a-Chip-Methoden zu tragbareren Diagnosetechniken führen.

Diese Abbildung skizziert den Prozess der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), der zur Identifizierung von Pathogenen verwendet wird.  Zunächst wird dem Patienten eine Probe des infizierten Gewebes entnommen.  Dann wird ein Oligonukleotid, das zum genetischen Code des vermuteten Pathogens komplementär ist, synthetisiert und mit einer fluoreszierenden Sonde chemisch markiert.  Die entnommene Gewebeprobe muss dann chemisch behandelt werden, um die Zellmembranen für das fluoreszenzmarkierte Oligonukleotid durchlässig zu machen.  Nachdem die Gewebeprobe behandelt wurde, wird das markierte komplementäre Oligonukleotid hinzugefügt.  Das fluoreszenzmarkierte Oligonukleotid bindet nur an die komplementäre DNA des vermuteten Pathogens.  Wenn der Erreger in der Gewebeprobe vorhanden ist, leuchten/fluoreszieren die Zellen des Erregers nach der Behandlung mit dem markierten Oligonukleotid.  Alle anderen Zellen leuchten nach der Behandlung nicht.
Allgemeiner Prozess der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) zur Identifizierung bakterieller Pathogene. Zunächst wird dem Patienten eine infizierte Gewebeprobe entnommen. Anschließend wird ein zum genetischen Code des vermuteten Pathogens komplementäres Oligonukleotid synthetisiert und mit einer fluoreszierenden Sonde chemisch markiert. Die Gewebeprobe wird chemisch behandelt, um die Zellmembranen für das fluoreszenzmarkierte Oligonukleotid durchlässig zu machen. Der fluoreszierende Tag wird dann hinzugefügt und bindet nur an die komplementäre DNA des vermuteten Erregers. Wenn der Erreger in der Gewebeprobe vorhanden ist, fluoreszieren die Zellen des Erregers nach der Behandlung mit dem markierten Oligonukleotid. Keine anderen Zellen leuchten.

Artenidentifikation

FISH wurde als diagnostisches Verfahren zur Identifizierung von Krankheitserregern im Bereich der medizinischen Mikrobiologie umfassend untersucht. Obwohl es sich als nützliches und anwendbares Verfahren erwiesen hat, wird es in diagnostischen Labors noch nicht weit verbreitet eingesetzt. Die kurze Zeit bis zur Diagnose (weniger als 2 Stunden) war ein großer Vorteil im Vergleich zur biochemischen Differenzierung, aber dieser Vorteil wird durch MALDI-TOF-MS, die die Identifizierung eines breiteren Spektrums von Krankheitserregern im Vergleich zu biochemischen Differenzierungstechniken ermöglicht, in Frage gestellt. Der Einsatz von FISH zu diagnostischen Zwecken hat seinen Zweck gefunden, wenn eine sofortige Speziesidentifikation erforderlich ist, insbesondere für die Untersuchung von Blutkulturen, für die FISH eine kostengünstige und einfache Technik zur vorläufigen Schnelldiagnose ist.

FISH kann auch verwendet werden, um die Genome zweier biologischer Arten zu vergleichen , um evolutionäre Beziehungen abzuleiten . Eine ähnliche Hybridisierungstechnik wird Zoo-Blot genannt . Bakterielle FISH-Sonden sind oft Primer für die 16s-rRNA- Region.

FISH wird häufig im Bereich der mikrobiellen Ökologie verwendet , um Mikroorganismen zu identifizieren . Biofilme zum Beispiel bestehen aus komplexen (oft) Multispezies-Bakterienorganisationen. Die Herstellung von DNA-Sonden für eine Spezies und die Durchführung von FISH mit dieser Sonde ermöglicht es, die Verteilung dieser spezifischen Spezies innerhalb des Biofilms zu visualisieren. Die Vorbereitung von Sonden (in zwei verschiedenen Farben) für zwei Arten ermöglicht es Forschern, die Co-Lokalisierung dieser beiden Arten im Biofilm zu visualisieren/zu untersuchen und kann bei der Bestimmung der feinen Architektur des Biofilms nützlich sein.

Vergleichende genomische Hybridisierung

Die vergleichende genomische Hybridisierung kann als eine Methode beschrieben werden, die FISH parallel zum Vergleich der Hybridisierungsstärke verwendet, um an größere Störungen im Duplikationsprozess der DNA-Sequenzen im Genom des Zellkerns zu erinnern.

Virtueller Karyotyp

Die virtuelle Karyotypisierung ist eine weitere kostengünstige, klinisch verfügbare Alternative zu FISH-Panels, bei der Tausende bis Millionen von Sonden auf einem einzigen Array verwendet werden, um genomweite Kopienzahländerungen mit beispielloser Auflösung zu erkennen. Gegenwärtig erkennt diese Art der Analyse nur Zuwächse und Verluste an chromosomalem Material und erkennt keine ausgewogenen Neuanordnungen, wie Translokationen und Inversionen, die charakteristische Aberrationen sind, die bei vielen Arten von Leukämie und Lymphomen auftreten.

Spektraler Karyotyp

Die spektrale Karyotypisierung ist ein Bild von farbigen Chromosomen. Die spektrale Karyotypisierung beinhaltet FISH unter Verwendung mehrerer Formen vieler Arten von Sonden mit dem Ergebnis, dass jedes Chromosom durch sein Metaphasenstadium markiert wird. Diese Art der Karyotypisierung wird speziell bei der Suche nach Chromosomenanordnungen verwendet.

Siehe auch

Galerie

Verweise

Weiterlesen

Externe Links