TILLING (Molekularbiologie) - TILLING (molecular biology)

TILLING ( Targeting Induced Local Lesions in Genomes ) ist eine Methode der Molekularbiologie , mit der Mutationen in einem bestimmten Gen gezielt identifiziert werden können . TILLING wurde im Jahr 2000 unter Verwendung der Modellpflanze Arabidopsis thaliana eingeführt und von einer kleinen Gruppe von Wissenschaftlern, darunter Luca Comai , auf andere Anwendungen und Methoden ausgeweitet . TILLING wird seither als reverse Genetik- Methode in anderen Organismen wie Zebrafisch , Mais , Weizen , Reis , Soja , Tomate und Salat eingesetzt .

Überblick

Die Methode kombiniert eine standardmäßige und effiziente Technik der Mutagenese unter Verwendung eines chemischen Mutagens wie Ethylmethansulfonat (EMS) mit einer empfindlichen DNA-Screening-Technik, die Einzelbasenmutationen (auch Punktmutationen genannt) in einem Zielgen identifiziert. Die TILLING-Methode beruht auf der Bildung von DNA- Heteroduplexen , die gebildet werden, wenn mehrere Allele durch PCR amplifiziert und dann erhitzt und langsam abgekühlt werden. An der Fehlpaarung der beiden DNA-Stränge bildet sich eine „ Blase “, die dann von einsträngigen Nukleasen gespalten wird . Die Produkte werden dann auf mehreren verschiedenen Plattformen nach Größe getrennt (siehe unten).

Nichtübereinstimmungen können auf induzierte Mutationen, Heterozygotie innerhalb eines Individuums oder natürliche Variation zwischen Individuen zurückzuführen sein.

EcoTILLING ist eine Methode, die TILLING-Techniken verwendet, um nach natürlichen Mutationen in Individuen zu suchen, normalerweise für die populationsgenetische Analyse. DEcoTILLING ist eine Modifikation von TILLING und EcoTILLING, die eine kostengünstige Methode zur Identifizierung von Fragmenten verwendet. Seit dem Aufkommen der NGS-Sequenzierungstechnologien wurde TILLING-by-sequencing basierend auf der Illumina-Sequenzierung von Zielgenen entwickelt, die aus mehrdimensional gepoolten Templates amplifiziert wurden, um mögliche Einzelnukleotidänderungen zu identifizieren.

Enzyme zur Einzelstrangspaltung

Es gibt mehrere Quellen für Einzelstrang-Nukleasen. Das erste weit verbreitete Enzym war Mungbohnen-Nuklease , aber diese Nuklease hat eine hohe unspezifische Aktivität und funktioniert nur bei niedrigem pH-Wert, wodurch PCR-Produkte und farbstoffmarkierte Primer abbauen können. Die ursprüngliche Quelle für Einzelstrangnuklease stammte von CEL1 oder CJE (Selleriesaftextrakt), aber andere Produkte sind auf den Markt gekommen, darunter die SNiPerase-Enzyme von Frontier Genomics, die für die Verwendung auf Plattformen optimiert wurden, die markierte und unmarkierte PCR-Produkte verwenden (siehe nächster Abschnitt). Transgenomic isoliert das einzelsträngige Nukleaseprotein und verkauft es als rekombinante Form. Der Vorteil der rekombinanten Form besteht darin, dass sie im Gegensatz zu den Enzymgemischen keine unspezifische Nukleaseaktivität enthält, die die Farbstoffe auf den PCR-Primern abbauen kann. Der Nachteil sind wesentlich höhere Kosten.

Trennung von gespaltenen Produkten

Das erste Papier, das TILLING beschreibt, verwendet HPLC , um Mutationen zu identifizieren (McCallum et al., 2000a). Das Verfahren wurde durch die Verwendung des Restriktionsenzyms Cel-I in Kombination mit dem LICOR-Gel-basierten System zur Identifizierung von Mutationen erhöht (Colbert et al., 2001). Vorteile bei der Verwendung dieses Systems sind, dass Mutationsstellen leicht bestätigt und vom Rauschen unterschieden werden können. Dies liegt daran, dass verschiedenfarbige Farbstoffe für die Vorwärts- und Rückwärtsprimer verwendet werden können. Sobald die Spaltprodukte auf einem Gel laufen gelassen wurden, können sie in separaten Kanälen betrachtet werden, und ähnlich wie bei einem RFLP sollten sich die Fragmentgrößen innerhalb einer Spur in jedem Kanal zur Gesamtlänge des Produkts addieren. Vorteile des LICOR-Systems sind die Trennung großer Fragmente (~ 2kb), hoher Probendurchsatz (96 Proben geladen auf Papierkämme) und Freeware zur Identifizierung der Mutationen (GelBuddy). Nachteile des LICOR-Systems sind das Gießen von Plattengelen und lange Laufzeiten (~4 Stunden). TILLING- und EcoTILLING-Methoden werden jetzt auf Kapillarsystemen von Advanced Analytical Technologies, ABI und Beckman verwendet.

Zur Trennung von PCR-Produkten, die nicht mit Farbstoffen markiert sind, können mehrere Systeme verwendet werden. Einfache Agarose-Elektrophoresesysteme trennen kostengünstig und mit Standard-Laborgeräten Spaltprodukte. Dies wurde verwendet, um SNPs in Kumpellachsen zu entdecken und wurde als DEcoTILLING bezeichnet. Der Nachteil dieses Systems ist die geringere Auflösung im Vergleich zu Polyacrylamidsystemen. Elchrom Scientific verkauft vorgefertigte Spreadex-Gele, die einen hohen Durchsatz haben und empfindlicher sind als Standard-Polyacrylamidgele. Advanced Analytical Technologies Inc verkauft das AdvanCE FS96 dsDNA Fluorescent System, ein 96-Kapillar-Elektrophoresesystem, das gegenüber herkömmlichen Methoden mehrere Vorteile bietet; einschließlich der Fähigkeit, große Fragmente (bis zu 40 kb) zu trennen, kein Entsalzungs- oder Präzipitationsschritt erforderlich, kurze Laufzeiten (~30 Minuten), Empfindlichkeit bis 5 pg/ul und keine Notwendigkeit für fluoreszenzmarkierte Primer.

TILLING-Zentren

Weltweit existieren mehrere TILLING-Zentren, die sich auf landwirtschaftlich wichtige Arten konzentrieren:

  • Reis – UC Davis (USA)
  • Mais – Purdue University (USA)
  • Brassica napus – University of British Columbia (CA)
  • Brassica rapa – John Innes Centre (Großbritannien)
  • Arabidopsis – Fred Hutchinson Krebsforschung
  • Sojabohnen – Southern Illinois University (USA)
  • Lotus und Medicago – John Innes Center (Großbritannien)
  • Weizen – UC Davis (USA)
  • Erbse, Tomate - INRA (Frankreich)
  • Tomate - RTGR, Universität Hyderabad (Indien)

Verweise

Wissenschaftliche Literatur

Externe Links