Gen-Targeting - Gene targeting

Ein chimäres Maus-Gen, das auf das Fellfarben-Gen der Agouti mit seinen Nachkommen abzielt

Gen-Targeting (auch Ersatzstrategie basierend auf homologe Rekombination ) ist eine genetische Technik, die homologe Rekombination verwendet , um ein endogenes Gen zu modifizieren . Das Verfahren kann verwendet werden, um ein Gen zu löschen, Exons zu entfernen , ein Gen hinzuzufügen und einzelne Basenpaare zu modifizieren ( Punktmutationen einzuführen ). Gen-Targeting kann permanent oder bedingt sein. Bedingungen können beispielsweise ein bestimmter Zeitpunkt während der Entwicklung / des Lebens des Organismus oder die Beschränkung auf ein bestimmtes Gewebe sein . Gen-Targeting erfordert die Erzeugung eines spezifischen Vektors für jedes interessierende Gen. Es kann jedoch für jedes Gen verwendet werden, unabhängig von der Transkriptionsaktivität oder Gengröße.

Methoden

Im Allgemeinen wird DNA, die einen Teil des Zielgens, ein Reportergen und einen (dominanten) selektierbaren Marker enthält , in Bakterien zusammengesetzt .

Gen-Targeting-Methoden sind für mehrere Modellorganismen etabliert und können je nach verwendeter Spezies variieren . Um bei Mäusen auf Gene zu zielen , wird die DNA in Kultur in embryonale Stammzellen von Mäusen eingefügt . Zellen , die mit dem Einsetzen kann zu einer Maus das Gewebe über beitragen Embryo - Injektion. Schließlich werden chimäre Mäuse gezüchtet, bei denen die modifizierten Zellen die Fortpflanzungsorgane bilden . Nach diesem Schritt basiert der gesamte Körper der Maus auf der ausgewählten embryonalen Stammzelle.

Wildtyp- Physcomitrella und Knockout-Moose : Abweichende Phänotypen induziert in Gen-Disruption-Bibliothekstransformanten. Physcomitrella-Wildtyp- und transformierte Pflanzen wurden auf Knop-Minimalmedium gezüchtet, um die Differenzierung und Entwicklung von Gametophoren zu induzieren . Zu jeder Pflanze wird eine Übersicht (obere Reihe, Maßstabsbalken entspricht 1 mm) und eine Nahaufnahme (untere Reihe, Maßstabsstrich entspricht 0,5 mm) angezeigt. A, Haploide Wildtyp-Moospflanze, die vollständig mit belaubten Gametophoren bedeckt ist, und Nahaufnahme des Wildtyp-Blattes. BD, Verschiedene Mutanten.

Um auf Gene im Moos abzuzielen , wird die DNA zusammen mit frisch isolierten Protoplasten und mit Polyethylenglykol inkubiert . Da Moose haploide Organismen sind, können Moosfilamente ( Protoneme ) direkt auf das Ziel gescreent werden, entweder durch Behandlung mit Antibiotika oder mit PCR . Dieses unter Pflanzen einzigartige Verfahren der reversen Genetik ist ebenso effizient wie bei der Hefe . Gen-Targeting wurde erfolgreich bei Rindern, Schafen, Schweinen und vielen Pilzen angewendet.

Die Häufigkeit des Gen-Targetings kann durch die Verwendung von manipulierten Endonukleasen wie Zinkfinger-Nukleasen , manipulierten Homing-Endonukleasen und Nukleasen basierend auf manipulierten TAL-Effektoren signifikant erhöht werden . Dieses Verfahren wurde auf Arten wie Drosophila melanogaster , Tabak , Mais , menschliche Zellen, Mäuse und Ratten angewendet .

Vergleich mit Gentrapping

Das Gen-Trapping basiert auf dem zufälligen Einfügen einer Kassette, während das Gen-Targeting ein bestimmtes Gen manipuliert. Kassetten können für viele verschiedene Dinge verwendet werden, während die flankierenden Homologiebereiche von Gen-Targeting-Kassetten für jedes Gen angepasst werden müssen. Dies macht das Gen-Trapping für Großprojekte leichter zugänglich als das Targeting. Andererseits kann Gen-Targeting für Gene mit geringen Transkriptionen verwendet werden, die in einem Fallen-Screening unentdeckt bleiben würden. Die Wahrscheinlichkeit des Einfangens steigt mit der Introngröße , während beim Gen-Targeting kleine Gene genauso leicht verändert werden können.

Anwendungen

Gen-Targeting wurde weithin verwendet, um genetische Erkrankungen des Menschen zu untersuchen , indem spezifische Mutationen von Interesse entfernt (" knocking out ") oder hinzugefügt ("knocking in") wurden. Früher zur Entwicklung von Rattenzellmodellen verwendet, ermöglichen Fortschritte in Gen-Targeting-Technologien eine neue Welle von isogenen menschlichen Krankheitsmodellen . Diese Modelle sind die genauesten In-vitro- Modelle, die Forschern zur Verfügung stehen, und erleichtern die Entwicklung personalisierter Medikamente und Diagnostika, insbesondere in der Onkologie .

Nobelpreis 2007

Mario R. Capecchi , Martin J. Evans und Oliver Smithies erhielten 2007 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin für ihre Arbeiten zu "Prinzipien zur Einführung spezifischer Genmodifikationen in Mäusen durch die Verwendung embryonaler Stammzellen" oder Gen-Targeting.

Siehe auch

Verweise

Externe Links