Intrazellulärer pH-Wert - Intracellular pH
Der intrazelluläre pH ( pHi ) ist das Maß für die Acidität oder Basizität ( dh pH ) der intrazellulären Flüssigkeit . Der pHi spielt eine entscheidende Rolle beim Membrantransport und anderen intrazellulären Prozessen. In einer Umgebung mit einem falschen pHi können biologische Zellen eine beeinträchtigte Funktion aufweisen. Daher wird der pHi genau reguliert, um eine ordnungsgemäße Zellfunktion, ein kontrolliertes Zellwachstum und normale Zellprozesse sicherzustellen. Die Mechanismen, die den pHi regulieren, werden normalerweise als Plasmamembrantransporter angesehen, von denen es zwei Haupttypen gibt – diejenigen, die von der Konzentration von Bicarbonat ( HCO .) abhängig sind und diejenigen, die unabhängig sind−
3). Der physiologisch normale intrazelluläre pH-Wert liegt am häufigsten zwischen 7,0 und 7,4, obwohl es Unterschiede zwischen den Geweben gibt (z. B. hat die Skelettmuskulatur von Säugetieren tendenziell einen pHi von 6,8–7,1). Es gibt auch pH-Variationen zwischen verschiedenen Organellen , die von etwa 4,5 bis 8,0 reichen können. pHi kann auf verschiedene Arten gemessen werden.
Homöostase
Der intrazelluläre pH-Wert ist aufgrund der geringeren Konzentrationen von HCO 3 – typischerweise niedriger als der extrazelluläre pH-Wert . Ein Anstieg des extrazellulären (z. B. Serum- ) Partialdrucks von Kohlendioxid ( pCO 2 ) über 45 mmHg führt zur Bildung von Kohlensäure , die bei der Dissoziation eine Abnahme des pHi verursacht :
- H 2 O + CO 2 ⇌ H 2 CO 3 ⇌ H + + HCO 3 –
Da biologische Zellen Flüssigkeit enthalten, die als Puffer wirken kann, kann der pHi innerhalb eines bestimmten Bereichs ziemlich gut gehalten werden. Zellen passen ihren pHi bei einem Anstieg der Säure oder Basizität entsprechend an, meist mit Hilfe von CO 2 oder HCO 3 – Sensoren, die in der Zellmembran vorhanden sind. Diese Sensoren können es H+ ermöglichen, entsprechend die Zellmembran zu passieren, was es ermöglicht, dass pHi in dieser Hinsicht mit dem extrazellulären pH-Wert in Wechselbeziehung steht.
Zu den wichtigsten intrazellulären Puffersystemen gehören diejenigen, die Proteine oder Phosphate beinhalten. Da die Proteine saure und basische Regionen aufweisen, können sie sowohl als Protonendonatoren als auch als Akzeptoren dienen, um einen relativ stabilen intrazellulären pH-Wert aufrechtzuerhalten. Im Falle eines Phosphatpuffers können erhebliche Mengen an schwacher Säure und konjugierter schwacher Base (H 2 PO 4 – und HPO 4 2– ) entsprechend Protonen aufnehmen oder abgeben, um den intrazellulären pH-Wert zu erhalten:
- OH – + H 2 PO 4 – ⇌ H 2 O + HPO 4 2–
- H + + HPO 4 2– ⇌ H 2 PO 4 –
In Organellen
Der pH-Wert innerhalb einer bestimmten Organelle ist auf ihre spezifische Funktion zugeschnitten.
Lysosomen haben beispielsweise einen relativ niedrigen pH-Wert von 4,5. Darüber hinaus haben Fluoreszenzmikroskopietechniken gezeigt, dass Phagozyten auch einen relativ niedrigen inneren pH-Wert aufweisen. Da es sich bei beiden um abbauende Organellen handelt, die andere Substanzen einhüllen und abbauen, benötigen sie einen hohen internen Säuregehalt, um ihre beabsichtigte Funktion erfolgreich zu erfüllen.
Im Gegensatz zu dem relativ niedrigen pH-Wert in Lysosomen und Phagozyten hat die mitochondriale Matrix einen internen pH-Wert von etwa 8,0, was etwa 0,9 pH-Einheiten höher ist als der des inneren Intermembranraums. Da die oxidative Phosphorylierung innerhalb der Mitochondrien erfolgen muss, ist diese pH-Diskrepanz notwendig, um einen Gradienten über die Membran zu erzeugen. Dieses Membranpotential ermöglicht es den Mitochondrien letztendlich, große Mengen an ATP zu erzeugen.
Messung
Es gibt mehrere übliche Wege, um den intrazellulären pH (pHi) zu messen, einschließlich mit einer Mikroelektrode, einem pH-empfindlichen Farbstoff oder mit kernmagnetischen Resonanztechniken. Zum Messen des pH-Werts im Inneren von Organellen kann eine Technik verwendet werden, die pH-empfindliche grün fluoreszierende Proteine (GFPs) verwendet.
Insgesamt haben alle drei Methoden ihre eigenen Vor- und Nachteile. Die Verwendung von Farbstoffen ist vielleicht am einfachsten und ziemlich genau, während NMR die Herausforderung darstellt, relativ weniger genau zu sein. Darüber hinaus kann die Verwendung einer Mikroelektrode in Situationen eine Herausforderung darstellen, in denen die Zellen zu klein sind oder die Intaktheit der Zellmembran ungestört bleiben soll. GFPs sind insofern einzigartig, als sie eine nichtinvasive Methode zur pH-Bestimmung innerhalb verschiedener Organellen bieten, jedoch ist diese Methode nicht die quantitativ genaueste Methode zur pH-Bestimmung.
Mikroelektrode
Die Mikroelektrodenmethode zur Messung des pHi besteht darin, eine sehr kleine Elektrode in das Zytosol der Zelle zu platzieren, indem ein sehr kleines Loch in die Plasmamembran der Zelle gebohrt wird. Da sich in der Mikroelektrode Flüssigkeit mit einer hohen H+-Konzentration im Inneren relativ zur Außenseite der Elektrode befindet, entsteht aufgrund der pH-Diskrepanz zwischen der Innenseite und der Außenseite der Elektrode ein Potential. Aus dieser Spannungsdifferenz und einem vorbestimmten pH-Wert für die Flüssigkeit innerhalb der Elektrode kann man den intrazellulären pH-Wert (pHi) der interessierenden Zelle bestimmen.
Fluoreszenzspektroskopie
Eine andere Möglichkeit, den intrazellulären pH-Wert (pHi) zu messen, sind Farbstoffe, die pH-empfindlich sind und bei verschiedenen pH-Werten unterschiedlich fluoreszieren. Bei dieser Technik, die sich der Fluoreszenzspektroskopie bedient, wird dieser spezielle Farbstoff dem Zytosol einer Zelle zugesetzt. Indem man den Farbstoff in der Zelle mit Lichtenergie anregt und die Wellenlänge des Lichts misst, das vom Photon bei seiner Rückkehr in seinen ursprünglichen Energiezustand freigesetzt wird, kann man die Art des vorhandenen Farbstoffs bestimmen und diesen mit dem intrazellulären pH-Wert des gegebenen in Beziehung setzen Zelle.
Kernspinresonanz
Neben der Verwendung von pH-empfindlichen Elektroden und Farbstoffen zur pHi-Messung kann auch die NMR-Spektroskopie (NMR) zur Quantifizierung des pHi verwendet werden. NMR, typischerweise gesagt, gibt Informationen über das Innere einer Zelle an, indem die Zelle in eine Umgebung mit einem starken Magnetfeld gebracht wird. Basierend auf dem Verhältnis zwischen den Konzentrationen von protonierten im Vergleich zu deprotonierten Formen von Phosphatverbindungen in einer gegebenen Zelle kann der innere pH-Wert der Zelle bestimmt werden. Darüber hinaus kann NMR auch verwendet werden, um das Vorhandensein von intrazellulärem Natrium aufzudecken, das auch Informationen über den pHi liefern kann.
Mittels NMR-Spektroskopie wurde festgestellt, dass Lymphozyten einen konstanten internen pH-Wert von 7,17 ± 0,06 aufrechterhalten, obwohl sich der intrazelluläre pH-Wert wie alle Zellen in die gleiche Richtung wie der extrazelluläre pH-Wert ändert.
pH-sensitive GFPs
Um den pH-Wert im Inneren von Organellen zu bestimmen, werden pH-sensitive GFPs häufig als Teil einer nichtinvasiven und effektiven Technik verwendet. Durch die Verwendung von cDNA als Matrize zusammen mit den geeigneten Primern kann das GFP-Gen im Zytosol exprimiert werden und die produzierten Proteine können auf spezifische Regionen innerhalb der Zelle, wie die Mitochondrien, den Golgi-Apparat, das Zytoplasma und das endoplasmatische Retikulum, abzielen. Wenn in diesen Experimenten bestimmte GFP-Mutanten verwendet werden, die in intrazellulären Umgebungen sehr empfindlich auf den pH-Wert reagieren, kann die relative Menge der resultierenden Fluoreszenz den ungefähren umgebenden pH-Wert aufdecken.