K-Kasein - K-casein

-Casein oder Kappa-Casein ist ein Säugetiermilchprotein , das an mehreren wichtigen physiologischen Prozessen beteiligt ist. Im Darm wird das aufgenommene Protein in ein unlösliches Peptid (Para-Kappa-Casein) und ein lösliches hydrophiles Glykopeptid (Caseinomakropeptid) gespalten. Caseinomakropeptid ist verantwortlich für eine gesteigerte Effizienz der Verdauung, die Verhinderung einer Überempfindlichkeit von Neugeborenen gegenüber aufgenommenen Proteinen und die Hemmung von Magenpathogenen.

Struktur

Molekulares Oberflächenmodell von K-Casein

Caseine sind eine Familie von Phosphoproteinen (αS1, αS2, β, κ), die fast 80% der Rindermilchproteine ​​ausmachen und lösliche Aggregate bilden, die als "Caseinmicellen" bekannt sind, in denen κ-Caseinmoleküle die Struktur stabilisieren. Es gibt mehrere Modelle, die die räumliche Konformation von Casein in den Mizellen erklären. Einer von ihnen schlägt vor, dass der Mizellenkern aus mehreren Submicellen besteht, wobei die Peripherie aus Mikrovellositäten von κ-Casein besteht. Ein anderes Modell legt nahe, dass der Kern aus mit Casein verbundenen Fibrillen gebildet wird. Schließlich schlägt das neueste Modell eine doppelte Verbindung zwischen den Kaseinen vor, damit die Gelierung stattfindet. Alle 3 Modelle betrachten Micellen als kolloidale Partikel, die von Caseinaggregaten gebildet werden, die in lösliche κ-Caseinmoleküle eingehüllt sind. Milchgerinnungsproteasen wirken auf den löslichen Teil, -Casein, und erzeugen so einen instabilen mizellaren Zustand, der zur Bildung von Gerinnseln führt.

Milchgerinnung

In rot/blauer Phe105-Met106-Bindung von κ-Casein

Chymosin (EC 3.4.23.4) ist eine Asparaginprotease , die spezifisch die Peptidbindung in Phe105-Met106 von κ-Casein hydrolysiert und als die effizienteste Protease für die Käseindustrie gilt. Es gibt jedoch milchgerinnende Proteasen, die in der Lage sind, andere Peptidbindungen in der κ-Casein-Kette zu spalten, wie das von Endothia parasitica produzierte Endothiapepsin . Es gibt auch mehrere milchgerinnende Proteasen, die in der Lage sind, die Phe105-Met106-Bindung im κ-Casein-Molekül zu spalten, aber auch andere Peptidbindungen in anderen Caseinen, wie sie von Cynara cardunculus oder sogar Rinder-Chymosin produziert werden. Dies ermöglicht die Herstellung verschiedener Käsesorten mit einer Vielzahl von rheologischen und organoleptischen Eigenschaften.

Der Milchgerinnungsprozess besteht aus drei Hauptphasen:

  1. Enzymatischer Abbau von κ-Casein.
  2. Mizellare Flockung.
  3. Gelbildung.

Jeder Schritt folgt einem anderen kinetischen Muster, wobei der limitierende Schritt bei der Milchgerinnung die Abbaurate von κ-Casein ist. Das kinetische Muster des zweiten Schrittes des Milchgerinnungsprozesses wird durch die kooperative Natur der mizellaren Flockung beeinflusst, während die rheologischen Eigenschaften des gebildeten Gels von der Art der Wirkung der Proteasen, der Art der Milch und den Mustern der Casein-Proteolyse. Der Gesamtprozess wird durch verschiedene Faktoren beeinflusst, wie zum Beispiel pH oder Temperatur.

Der herkömmliche Weg zur Quantifizierung eines gegebenen Milchgerinnungsenzyms verwendet Milch als Substrat und bestimmt die verstrichene Zeit bis zum Auftreten von Milchgerinnseln. Die Milchgerinnung kann jedoch aufgrund von Variationen in physikalisch-chemischen Faktoren, wie niedrigem pH oder hoher Temperatur, ohne Beteiligung von Enzymen stattfinden. Dies kann folglich zu verwirrenden und nicht reproduzierbaren Ergebnissen führen, insbesondere wenn die Enzyme eine geringe Aktivität aufweisen. Gleichzeitig ist die klassische Methode nicht spezifisch genug, um den genauen Beginn der Milchgelierung einzustellen, so dass die Bestimmung der beteiligten enzymatischen Einheiten schwierig und unklar wird. Obwohl berichtet wurde, dass die κ-Casein-Hydrolyse einer typischen Michaelis-Menten- Kinetik folgt , ist sie mit dem klassischen Milchgerinnungsassay schwer zu bestimmen.

Um dies zu überwinden, wurden mehrere alternative Verfahren vorgeschlagen, wie die Bestimmung des Halodurchmessers in agargelierter Milch, kolorimetrische Messung oder Bestimmung der Abbaugeschwindigkeit von Casein, das zuvor entweder mit einem radioaktiven Tracer oder einer Fluorochromverbindung markiert wurde . Alle diese Methoden verwenden Casein als Substrat, um proteolytische oder milchgerinnende Aktivitäten zu quantifizieren.

FTC-Κ-Casein-Assay

Fluoresceinisothiocyanat

-Casein, markiert mit dem Fluorochrom- Fluorescein-Isothiocyanat ( FITC ), um das Fluorescein-Thiocarbamoyl-( FTC )-Derivat zu ergeben. Dieses Substrat wird verwendet, um die Milchgerinnungsaktivität von Proteasen zu bestimmen.

Die FTC-κ-Casein-Methode ermöglicht genaue und präzise Bestimmungen des κ-caseinolytischen Abbaus, dem ersten Schritt im Milchgerinnungsprozess. Diese Methode ist das Ergebnis einer Modifikation der von SS Twining (1984) beschriebenen Methode. Die Hauptmodifikation bestand darin, das zuvor verwendete Substrat ( Casein ) durch κ-Casein zu ersetzen, das mit dem Fluorochrom-Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) markiert war, um das Fluorescein-Thiocarbamoyl-(FTC)-Derivat zu ergeben. Diese Variation ermöglicht eine genauere und spezifischere Quantifizierung der abgebauten -Casein-Moleküle, wobei nur die Enzyme nachgewiesen werden, die solche Moleküle abbauen können. Das von Twining (1984) beschriebene Verfahren wurde jedoch entwickelt, um die proteolytische Aktivität einer erheblich größeren Vielfalt von Enzymen nachzuweisen. FTC-κ-Casein ermöglicht den Nachweis verschiedener Arten von Proteasen in Konzentrationen, in denen noch keine Milchgerinnung erkennbar ist, was seine höhere Sensitivität gegenüber derzeit verwendeten Assay-Verfahren demonstriert. Daher kann das Verfahren als Indikator bei der Reinigung oder Charakterisierung neuer Milchgerinnungsenzyme Anwendung finden.

Anmerkungen

Verweise

Externe Links