lac- Operon - lac operon
Das Lactose- Operon ( lac- Operon) ist ein Operon, das für den Transport und den Metabolismus von Lactose in E. coli und vielen anderen Darmbakterien benötigt wird . Obwohl Glucose die bevorzugte Kohlenstoffquelle für die meisten Bakterien ist, ermöglicht das lac- Operon die effektive Verdauung von Lactose, wenn Glucose durch die Aktivität von Beta-Galactosidase nicht verfügbar ist . Die Genregulation des lac- Operons war der erste genetische Regulationsmechanismus, der klar verstanden wurde, so dass es zu einem führenden Beispiel für prokaryontische Genregulation wurde . Aus diesem Grund wird es oft in einführenden Kursen in Molekular- und Zellbiologie diskutiert . Dieses Laktose-Stoffwechselsystem wurde von François Jacob und Jacques Monod verwendet , um zu bestimmen, wie eine biologische Zelle weiß, welches Enzym sie synthetisieren muss. Ihre Arbeit am lac- Operon brachte ihnen 1965 den Nobelpreis für Physiologie ein.
Bakterielle Operons sind polycistronische Transkripte , die mehrere Proteine aus einem mRNA- Transkript produzieren können. In diesem Fall können, wenn Lactose als Zuckerquelle für das Bakterium benötigt wird, die drei Gene des lac- Operons exprimiert und ihre nachfolgenden Proteine translatiert werden: lacZ , lacY und lacA . Das Genprodukt von lacZ ist β-Galactosidase , die Lactose, ein Disaccharid , in Glucose und Galactose spaltet . lacY kodiert für Beta-Galactosid-Permease , ein Membranprotein, das in die zytoplasmatische Membran eingebettet wird , um den zellulären Transport von Lactose in die Zelle zu ermöglichen. Schließlich kodiert lacA für Galactosid-Acetyltransferase .
Es wäre verschwenderisch, Enzyme zu produzieren, wenn keine Laktose verfügbar ist oder wenn eine bevorzugte Energiequelle wie Glukose verfügbar wäre. Das lac- Operon verwendet einen zweiteiligen Kontrollmechanismus, um sicherzustellen, dass die Zelle nur dann Energie aufwendet, um die vom lac- Operon kodierten Enzyme zu produzieren, wenn es notwendig ist. In Abwesenheit von Lactose, die lac - Repressor , lacI, codiert stoppt Produktion der Enzyme durch den lac - Operon. Der lac-Repressor wird immer exprimiert, es sei denn, ein Co-Induktor bindet daran. Mit anderen Worten, es wird nur in Gegenwart eines niedermolekularen Co-Induktors transkribiert. In Gegenwart von Glukose bleibt das für die Produktion der Enzyme erforderliche Katabolit-Aktivatorprotein (CAP) inaktiv und EIIA Glc schaltet die Laktosepermease ab, um den Transport von Laktose in die Zelle zu verhindern. Dieser duale Kontrollmechanismus bewirkt die sequentielle Verwertung von Glucose und Lactose in zwei unterschiedlichen Wachstumsphasen, die als Diauxie bekannt sind .
Struktur
- Das lac- Operon besteht aus 3 Strukturgenen und einem Promotor , einem Terminator , Regulator und einem Operator . Die drei Strukturgene sind: lacZ , lacY und lacA .
- lacZ kodiert für β-Galactosidase (LacZ), ein intrazelluläres Enzym , das das Disaccharid Lactose in Glucose und Galactose spaltet .
- lacY kodiert für Beta-Galactosid-Permease (LacY), einen Transmembran- Symporter , der β-Galactoside einschließlich Lactose unter Verwendung eines Protonengradienten in die gleiche Richtung in die Zelle pumpt . Permease erhöht die Durchlässigkeit der Zelle für β-Galaktoside .
- lacA kodiert für β-Galactosid-Transacetylase (LacA), ein Enzym, das eine Acetylgruppe von Acetyl-CoA auf Thiogalactosid überträgt.
Nur lacZ und lacY erscheinen für Laktose notwendig sein Abbauweg .
Genetische Nomenklatur
Drei-Buchstaben-Abkürzungen werden verwendet, um Phänotypen in Bakterien einschließlich E. coli zu beschreiben .
Beispiele beinhalten:
- Lac (die Fähigkeit, Laktose zu verwenden),
- His (die Fähigkeit, die Aminosäure Histidin zu synthetisieren)
- Mot (Schwimmmotilität)
- Sm R (Resistenz gegen das Antibiotikum Streptomycin )
Im Fall von Lac sind Wildtypzellen Lac + und können Lactose als Kohlenstoff- und Energiequelle verwenden, während Lac – mutante Derivate keine Lactose verwenden können. Dieselben drei Buchstaben werden typischerweise verwendet (Kleinbuchstaben, kursiv), um die Gene zu kennzeichnen, die an einem bestimmten Phänotyp beteiligt sind, wobei jedes unterschiedliche Gen zusätzlich durch einen zusätzlichen Buchstaben unterschieden wird. Die Enzyme codierenden lac- Gene sind lacZ , lacY und lacA . Das vierte lac- Gen ist lacI , das für den Lactose-Repressor kodiert – "I" steht für Induzierbarkeit .
Man kann zwischen Strukturgenen , die für Enzyme kodieren, und regulatorischen Genen, die Proteine kodieren, die die Genexpression beeinflussen, unterscheiden. Die gegenwärtige Verwendung erweitert die phänotypische Nomenklatur auf Proteine: LacZ ist somit das Proteinprodukt des lacZ- Gens, β-Galactosidase. Verschiedene kurze Sequenzen, die keine Gene sind, beeinflussen auch die Genexpression, einschließlich des lac- Promotors lac p und des lac- Operators lac o . Obwohl es sich nicht um eine strikte Standardverwendung handelt, werden Mutationen, die lac o betreffen , aus historischen Gründen als lac o c bezeichnet.
Induktor
Verordnung
Die spezifische Kontrolle der lac- Gene hängt von der Verfügbarkeit des Substrats Lactose für das Bakterium ab. Die Proteine werden vom Bakterium nicht produziert, wenn Laktose als Kohlenstoffquelle nicht verfügbar ist. Die lac- Gene sind in einem Operon organisiert ; das heißt, sie sind in der gleichen Richtung unmittelbar benachbart auf dem Chromosom orientiert und werden in ein einzelnes polycistronisches mRNA-Molekül co-transkribiert . Die Transkription aller Gene beginnt mit der Bindung des Enzyms RNA-Polymerase (RNAP), einem DNA-bindenden Protein , das an eine spezifische DNA-Bindungsstelle, den Promotor , unmittelbar vor den Genen bindet . Die Bindung der RNA-Polymerase an den Promotor wird durch das cAMP- gebundene Katabolit-Aktivatorprotein (CAP, auch als cAMP-Rezeptorprotein bekannt) unterstützt. Das lacI- Gen (regulatorisches Gen für das lac- Operon) produziert jedoch ein Protein, das die Bindung von RNAP an den Operator des Operons blockiert. Dieses Protein kann nur entfernt werden, wenn Allolactose daran bindet und es inaktiviert. Das Protein, das vom lacI- Gen gebildet wird, ist als lac-Repressor bekannt. Die Art der Regulation, der das lac- Operon unterliegt, wird als negativ induzierbar bezeichnet, was bedeutet, dass das Gen durch den regulatorischen Faktor ( lac- Repressor) ausgeschaltet wird, es sei denn, ein Molekül (Laktose) wird hinzugefügt. Aufgrund des Vorhandenseins des lac- Repressorproteins müssen Gentechniker, die das lacZ- Gen durch ein anderes Gen ersetzen , die experimentellen Bakterien auf Agar mit darauf verfügbarer Laktose züchten. Wenn dies nicht der Fall ist, wird das Gen, das sie zu exprimieren versuchen, nicht exprimiert, da das Repressorprotein immer noch RNAP daran hindert, an den Promotor zu binden und das Gen zu transkribieren. Sobald der Repressor entfernt ist, fährt RNAP fort, alle drei Gene ( lacZYA ) in mRNA zu transkribieren. Jedes der drei Gene auf dem mRNA-Strang hat seine eigene Shine-Dalgarno-Sequenz , sodass die Gene unabhängig voneinander translatiert werden. Die DNA-Sequenz des lac- Operons von E. coli , die lacZYA- mRNA und die lacI- Gene sind von GenBank erhältlich (Ansicht) .
Der erste Kontrollmechanismus ist die regulatorische Reaktion auf Lactose, die ein intrazelluläres regulatorisches Protein, den sogenannten Lactose-Repressor , verwendet, um die Produktion von β-Galactosidase in Abwesenheit von Lactose zu verhindern. Das für den Repressor kodierende lacI- Gen liegt in der Nähe des lac- Operons und wird immer exprimiert ( konstitutiv ). Wenn Lactose im Wachstumsmedium fehlt, bindet der Repressor sehr fest an eine kurze DNA-Sequenz direkt stromabwärts des Promotors nahe dem Beginn von lacZ, genannt lac-Operator . Die Bindung des Repressors an den Operator stört die Bindung von RNAP an den Promotor, und daher wird für LacZ und LacY kodierende mRNA nur in sehr geringen Mengen hergestellt. Wenn Zellen in Gegenwart von Laktose gezüchtet werden , bindet jedoch ein Laktosemetabolit namens Allolactose, der aus Laktose durch das Produkt des lacZ- Gens hergestellt wird, an den Repressor und verursacht eine allosterische Verschiebung. Auf diese Weise verändert, kann der Repressor nicht an den Operator binden, was es RNAP ermöglicht, die lac- Gene zu transkribieren und dadurch zu höheren Spiegeln der kodierten Proteine führt.
Der zweite Kontrollmechanismus ist eine Reaktion auf Glukose, die das Homodimer des Katabolitaktivatorproteins (CAP) verwendet, um die Produktion von β-Galactosidase in Abwesenheit von Glukose stark zu erhöhen. Zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) ist ein Signalmolekül, dessen Prävalenz umgekehrt proportional zu der von Glucose ist. Es bindet an das CAP, was wiederum dem CAP ermöglicht, an die CAP-Bindungsstelle zu binden (eine 16 bp DNA-Sequenz stromaufwärts des Promotors links im Diagramm unten, etwa 60 bp stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle), was dabei hilft die RNAP bei der Bindung an die DNA. In Abwesenheit von Glucose ist die cAMP-Konzentration hoch und die Bindung von CAP-cAMP an die DNA erhöht die Produktion von β-Galactosidase signifikant, wodurch die Zelle Lactose hydrolysieren und Galactose und Glucose freisetzen kann.
Vor kurzem wurde gezeigt, dass der Induktor-Ausschluss die Expression des lac- Operons blockiert, wenn Glucose vorhanden ist. Glucose wird durch das PEP-abhängige Phosphotransferase-System in die Zelle transportiert . Die Phosphatgruppe von Phosphoenolpyruvat wird über eine Phosphorylierungskaskade übertragen, die aus den allgemeinen PTS (Phosphotransferase System) Proteinen HPr und EIA und den Glucose-spezifischen PTS Proteinen EIIA Glc und EIIB Glc besteht , der zytoplasmatischen Domäne des EII Glucosetransporters. Der Transport von Glucose wird von ihrer Phosphorylierung durch EIIB Glc begleitet , wodurch die Phosphatgruppe von den anderen PTS-Proteinen, einschließlich EIIA Glc , abgeführt wird . Die unphosphorylierte Form von EIIA Glc bindet an die Lac- Permease und verhindert, dass sie Lactose in die Zelle einbringt . Wenn sowohl Glucose als auch Lactose vorhanden sind, blockiert der Transport von Glucose den Transport des Induktors des lac- Operons.
Repressorstruktur
Der lac-Repressor ist ein vierteiliges Protein, ein Tetramer, mit identischen Untereinheiten. Jede Untereinheit enthält ein Helix-Turn-Helix (HTH)-Motiv, das an DNA binden kann. Die Operatorstelle, an die der Repressor bindet, ist eine DNA-Sequenz mit umgekehrter Wiederholungssymmetrie. Die beiden DNA-Halbstellen des Operators binden zusammen an zwei der Untereinheiten des Repressors. Obwohl die anderen beiden Untereinheiten des Repressors in diesem Modell nichts bewirken, wurde diese Eigenschaft viele Jahre lang nicht verstanden.
Schließlich wurde entdeckt, dass zwei weitere Operatoren an der Lac- Regulierung beteiligt sind. Einer (O 3 ) liegt etwa –90 bp stromaufwärts von O 1 am Ende des lacI- Gens, und der andere (O 2 ) liegt etwa +410 bp stromabwärts von O 1 im frühen Teil von lacZ . Diese beiden Stellen wurden in der frühen Arbeit nicht gefunden, da sie redundante Funktionen haben und einzelne Mutationen die Repression nicht sehr beeinflussen. Einzelne Mutationen zu O 2 oder O 3 haben nur 2- bis 3-fache Auswirkungen. Ihre Bedeutung wird jedoch durch die Tatsache demonstriert, dass eine Doppelmutante, die sowohl in O 2 als auch in O 3 defekt ist, dramatisch dereprimiert wird (um etwa das 70-fache).
Im aktuellen Modell wird der lac- Repressor gleichzeitig an den Hauptoperator O 1 und entweder an O 2 oder O 3 gebunden . Die dazwischenliegende DNA schleift aus dem Komplex heraus. Die Redundanz der beiden Nebenoperatoren legt nahe, dass es sich nicht um einen bestimmten Schleifenkomplex handelt, der von Bedeutung ist. Eine Idee ist, dass das System durch Tethering funktioniert; wenn der gebundene Repressor vorübergehend von O 1 freigesetzt wird, hält ihn die Bindung an einen Nebenoperator in der Nähe, so dass er schnell wieder binden kann. Dies würde die Affinität des Repressors für O 1 erhöhen .
Mechanismus der Induktion
Der Repressor ist ein allosterisches Protein , dh er kann eine von zwei leicht unterschiedlichen Formen annehmen, die miteinander im Gleichgewicht stehen. In einer Form bindet der Repressor mit hoher Spezifität an die Operator-DNA, in der anderen hat er seine Spezifität verloren. Nach dem klassischen Induktionsmodell beeinflusst die Bindung des Induktors, entweder Allolactose oder IPTG, an den Repressor die Verteilung des Repressors zwischen den beiden Formen. Somit wird ein Repressor mit gebundenem Induktor in der nicht-DNA-bindenden Konformation stabilisiert. Dieses einfache Modell kann jedoch nicht die ganze Geschichte sein, denn Repressor ist zwar recht stabil an DNA gebunden, wird aber durch Zugabe von Induktor schnell freigesetzt. Daher scheint es klar, dass ein Induktor auch an den Repressor binden kann, wenn der Repressor bereits an DNA gebunden ist. Der genaue Bindungsmechanismus ist noch nicht vollständig bekannt.
Rolle der unspezifischen Bindung
Die unspezifische Bindung des Repressors an DNA spielt eine entscheidende Rolle bei der Repression und Induktion des Lac-Operons. Die spezifische Bindungsstelle für das Lac-Repressor-Protein ist der Operator. Die unspezifische Wechselwirkung wird hauptsächlich durch Ladungs-Ladungs-Wechselwirkungen vermittelt, während die Bindung an den Operator durch hydrophobe Wechselwirkungen verstärkt wird. Darüber hinaus gibt es eine Fülle von unspezifischen DNA-Sequenzen, an die der Repressor binden kann. Im Wesentlichen wird jede Sequenz, die nicht der Operator ist, als unspezifisch betrachtet. Studien haben gezeigt, dass ohne das Vorhandensein einer unspezifischen Bindung eine Induktion (oder Nichtrepression) des Lac-Operons selbst bei gesättigten Induktorspiegeln nicht stattfinden könnte. Es wurde gezeigt, dass ohne unspezifische Bindung das Grundniveau der Induktion zehntausendmal kleiner ist als normalerweise beobachtet. Dies liegt daran, dass die unspezifische DNA als eine Art "Senke" für die Repressorproteine fungiert und sie vom Operator ablenkt. Die unspezifischen Sequenzen verringern die Menge an verfügbarem Repressor in der Zelle. Dies reduziert wiederum die Menge an Induktor, die erforderlich ist, um das System nicht zu unterdrücken.
Lactose-Analoga
Es wurde eine Reihe von Lactose-Derivaten oder -Analoga beschrieben, die für die Arbeit mit dem lac- Operon nützlich sind . Bei diesen Verbindungen handelt es sich hauptsächlich um substituierte Galactoside, bei denen der Glucoseanteil der Lactose durch eine andere chemische Gruppe ersetzt wird.
- Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) wird häufig als Induktor des lac- Operons für physiologische Arbeiten verwendet. IPTG bindet an den Repressor und inaktiviert ihn, ist aber kein Substrat für β-Galactosidase. Ein Vorteil von IPTG für in vivo- Studien besteht darin, dass seine Konzentration konstant bleibt und die Expressionsrate von lac p/o- kontrollierten Genen im Experiment keine Variable ist, da es nicht von E. coli metabolisiert werden kann . Die Aufnahme von IPTG hängt von der Wirkung der Lactosepermease bei P. fluorescens ab , nicht jedoch bei E. coli .
- Phenyl-β-D-galactose (Phenyl-Gal) ist ein Substrat für β-Galactosidase, inaktiviert jedoch keinen Repressor und ist somit kein Induktor. Da Wildtypzellen sehr wenig β-Galactosidase produzieren, können sie nicht auf Phenyl-Gal als Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen. Mutanten ohne Repressor können auf Phenyl-Gal wachsen. Somit ist Minimalmedium, das nur Phenyl-Gal als Kohlenstoff- und Energiequelle enthält, selektiv für Repressormutanten und Operatormutanten. Wenn 10 8 Zellen eines Wildtyp-Stamms auf Phenyl-Gal enthaltenden Agarplatten ausplattiert werden, sind die seltenen Kolonien, die wachsen, hauptsächlich spontane Mutanten, die den Repressor beeinflussen. Die relative Verteilung von Repressor- und Operatormutanten wird durch die Zielgröße beeinflusst. Da das für den Repressor kodierende lacI-Gen etwa 50-mal größer ist als der Operator, überwiegen Repressormutanten bei der Selektion.
- Thiomethylgalactosid [TMG] ist ein weiteres Lactose-Analogon. Diese hemmen den lacI-Repressor. Bei niedrigen Induktorkonzentrationen können sowohl TMG als auch IPTG durch die Lactosepermease in die Zelle gelangen. Bei hohen Induktorkonzentrationen können jedoch beide Analoga unabhängig in die Zelle eindringen. TMG kann die Wachstumsraten bei hohen extrazellulären Konzentrationen reduzieren.
- Andere Verbindungen dienen als farbige Indikatoren der β-Galactosidase-Aktivität.
- ONPG wird gespalten, um die intensiv gelbe Verbindung, Orthonitrophenol und Galactose, zu produzieren , und wird üblicherweise als Substrat für den in vitro- Test von β-Galactosidase verwendet .
- Kolonien, die β-Galactosidase produzieren, werden durch X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid) blau gefärbt, das ein künstliches Substrat für B-Galactosidase ist, deren Spaltung zu Galactose und 4-Cl . führt ,3-Br-Indigo erzeugt somit eine tiefblaue Farbe.
- Allolactose ist ein Isomer von Lactose und ist der Induktor des lac- Operons. Lactose ist Galactose-β(1→4)-Glucose, während Allolactose Galactose-β(1→6)-Glucose ist. Lactose wird durch β-Galactosidase in einer alternativen Reaktion zur hydrolytischen Reaktion in Allolactose umgewandelt. Ein physiologisches Experiment, das die Rolle von LacZ bei der Produktion des "wahren" Induktors in E. coli- Zellen demonstriert , ist die Beobachtung, dass eine Nullmutante von lacZ immer noch LacY-Permease produzieren kann, wenn sie mit IPTG, einem nicht hydrolysierbaren Analogon von Allolactose, gezüchtet wird, aber nicht, wenn mit Laktose angebaut. Die Erklärung ist, dass die Verarbeitung von Lactose zu Allolactose (katalysiert durch β-Galactosidase) erforderlich ist, um den Induktor innerhalb der Zelle zu produzieren.
Entwicklung des klassischen Modells
Der experimentelle Mikroorganismus, der von François Jacob und Jacques Monod verwendet wurde, war das übliche Laborbakterium E. coli , aber viele der grundlegenden regulatorischen Konzepte, die von Jacob und Monod entdeckt wurden, sind grundlegend für die zelluläre Regulation in allen Organismen. Die Schlüsselidee ist, dass Proteine nicht synthetisiert werden, wenn sie nicht benötigt werden – E. coli spart zelluläre Ressourcen und Energie, indem sie die drei Lac-Proteine nicht produziert, wenn keine Notwendigkeit besteht, Laktose zu metabolisieren, beispielsweise wenn andere Zucker wie Glukose verfügbar sind. Im folgenden Abschnitt wird erläutert, wie E. coli bestimmte Gene als Reaktion auf den Stoffwechselbedarf steuert.
Während des Zweiten Weltkriegs testete Monod die Wirkung von Zuckerkombinationen als Nährstoffquellen für E. coli und B. subtilis . Monod verfolgte ähnliche Studien, die von anderen Wissenschaftlern mit Bakterien und Hefe durchgeführt worden waren. Er fand heraus, dass Bakterien, die mit zwei verschiedenen Zuckern gezüchtet wurden, oft zwei Wachstumsphasen aufwiesen. Wurden beispielsweise sowohl Glukose als auch Laktose bereitgestellt, wurde zunächst Glukose (Wachstumsphase I, siehe Abbildung 2) und dann Laktose (Wachstumsphase II) verstoffwechselt. Lactose wurde während des ersten Teils der diauxischen Wachstumskurve nicht metabolisiert, da β-Galactosidase nicht gebildet wurde, wenn sowohl Glucose als auch Lactose im Medium vorhanden waren. Monod nannte dieses Phänomen diauxie .
Monod konzentrierte sich dann auf die Induktion der β-Galactosidase-Bildung, die auftrat, wenn Lactose der einzige Zucker im Kulturmedium war.
Klassifizierung regulatorischer Mutanten
Ein konzeptioneller Durchbruch von Jacob und Monod bestand darin, den Unterschied zwischen regulatorischen Substanzen und Stellen zu erkennen, an denen sie die Genexpression verändern. Als ehemaliger Soldat benutzte Jacob die Analogie eines Bombers, der seine tödliche Ladung nach Empfang einer speziellen Funkübertragung oder eines speziellen Signals freisetzte. Ein funktionierendes System erfordert sowohl einen Bodensender als auch einen Empfänger im Flugzeug. Angenommen, der übliche Sender ist kaputt. Dieses System kann durch Einführung eines zweiten, funktionsfähigen Senders zum Laufen gebracht werden. Betrachten Sie dagegen einen Bomber mit defektem Empfänger. Das Verhalten dieses Bombers kann durch die Einführung eines zweiten, funktionsfähigen Flugzeugs nicht geändert werden.
Um regulatorische Mutanten des lac- Operons zu analysieren , entwickelte Jacob ein System, mit dem eine zweite Kopie der lac- Gene ( lacI mit seinem Promotor und lacZYA mit Promotor und Operator) in eine einzelne Zelle eingeführt werden konnte. Eine Kultur solcher Bakterien, die für die lac- Gene diploid , aber ansonsten normal sind, wird dann auf den regulatorischen Phänotyp getestet. Insbesondere wird bestimmt, ob LacZ und LacY auch in Abwesenheit von IPTG hergestellt werden (aufgrund des nicht funktionsfähigen Lactose-Repressors, der durch das mutierte Gen produziert wird). Dieses Experiment, bei dem Gene oder Gencluster paarweise getestet werden, nennt man Komplementationstest .
Dieser Test ist in der Figur dargestellt ( lacA wurde der Einfachheit halber weggelassen). Zuerst werden bestimmte haploide Zustände gezeigt (dh die Zelle trägt nur eine einzige Kopie der lac- Gene). Tafel (a) zeigt die Repression, (b) zeigt die Induktion durch IPTG und (c) und (d) zeigen die Wirkung einer Mutation auf das lacI- Gen bzw. auf den Operator. In Tafel (e) ist der Komplementationstest für Repressor gezeigt. Wenn eine Kopie der lac- Gene eine Mutation in lacI trägt, die zweite Kopie jedoch ein Wildtyp für lacI ist , ist der resultierende Phänotyp normal – aber lacZ wird exprimiert, wenn es dem Induktor IPTG ausgesetzt wird. Mutationen, die den Repressor beeinflussen, sollen gegenüber dem Wildtyp rezessiv sein (und dieser Wildtyp ist dominant ), und dies wird durch die Tatsache erklärt, dass der Repressor ein kleines Protein ist, das in der Zelle diffundieren kann. Die Kopie des lac- Operons, die dem defekten lacI- Gen benachbart ist, wird durch Protein, das aus der zweiten Kopie von lacI produziert wird, wirksam abgeschaltet .
Wird das gleiche Experiment mit einer Operator-Mutation durchgeführt, erhält man ein anderes Ergebnis (Panel (f)). Der Phänotyp einer Zelle, die eine Mutanten- und eine Wildtyp-Operatorstelle trägt, besteht darin, dass LacZ und LacY sogar in Abwesenheit des Induktors IPTG produziert werden; weil die beschädigte Operatorstelle keine Bindung des Repressors erlaubt, um die Transkription der Strukturgene zu hemmen. Die Operatormutation ist dominant. Wenn die Operatorstelle, an die der Repressor binden muss, durch Mutation beschädigt ist, macht das Vorhandensein einer zweiten funktionellen Stelle in derselben Zelle keinen Unterschied für die Expression von Genen, die durch die mutierte Stelle kontrolliert werden.
Eine ausgefeiltere Version dieses Experiments verwendet markierte Operons, um zwischen den beiden Kopien der lac- Gene zu unterscheiden und zu zeigen, dass das/die unregulierten Strukturgen(e) das(die) neben dem mutierten Operator ist/sind (Panel (g). Angenommen, eine Kopie ist durch eine Mutation markiert, die lacZ inaktiviert, sodass sie nur das LacY-Protein produzieren kann, während die zweite Kopie eine Mutation trägt, die lacY beeinflusst und nur LacZ produzieren kann.In dieser Version ist nur die Kopie des lac- Operons die dem mutierten Operator benachbart ist, wird ohne IPTG exprimiert.Wir sagen, dass die Operator-Mutation cis-dominant ist , sie ist dominant zum Wildtyp,betrifft jedoch nur die Kopie des Operons, die unmittelbar benachbart ist.
Diese Erklärung ist in einem wichtigen Sinne irreführend, denn sie geht von einer Beschreibung des Experiments aus und erklärt dann die Ergebnisse modellhaft. Tatsächlich ist es jedoch oft so, dass das Modell an erster Stelle steht und ein Experiment speziell entwickelt wird, um das Modell zu testen. Jacob und Monod stellten sich zunächst vor, dass es in der DNA eine Stelle mit den Eigenschaften des Operators geben muss, und entwickelten dann ihre Komplementationstests, um dies zu zeigen.
Die Dominanz von Operatormutanten legt auch ein Verfahren nahe, um sie spezifisch auszuwählen. Wenn regulatorische Mutanten aus einer Kultur des Wildtyps unter Verwendung von Phenyl-Gal selektiert werden, wie oben beschrieben, sind Operatormutationen im Vergleich zu Repressormutanten selten, da die Zielgröße so klein ist. Wenn wir jedoch stattdessen mit einem Stamm beginnen, der zwei Kopien der gesamten lac- Region trägt (d. h. diploid für lac ), werden die Repressor-Mutationen (die immer noch auftreten) nicht wiederhergestellt, da die Komplementierung durch das zweite Wildtyp- lacI- Gen einen Wildtyp verleiht Phänotyp. Im Gegensatz dazu verleiht die Mutation einer Kopie des Operators einen mutierten Phänotyp, da er gegenüber der zweiten Wildtyp-Kopie dominant ist.
Regulierung durch zyklisches AMP
Die Erklärung der Diauxie hing von der Charakterisierung zusätzlicher Mutationen ab, die die lac- Gene außer den durch das klassische Modell erklärten beeinflussen. Zwei weitere Gene, cya und crp , wurden anschließend identifiziert, die weit von lac entfernt kartiert wurden und die, wenn sie mutiert sind, zu einem verringerten Expressionsniveau in Gegenwart von IPTG und sogar in Bakterienstämmen, denen der Repressor oder Operator fehlt, führen. Die Entdeckung von cAMP in E. coli führte zu dem Nachweis, dass Mutanten, bei denen das cya- Gen, aber nicht das crp- Gen defekt war, durch die Zugabe von cAMP zum Medium zu voller Aktivität wiederhergestellt werden konnten.
Das cya- Gen kodiert für die Adenylatcyclase, die cAMP produziert. In einer cya- Mutante führt die Abwesenheit von cAMP dazu, dass die Expression der lacZYA- Gene mehr als zehnmal niedriger als normal ist. Die Zugabe von cAMP korrigiert die niedrige Lac-Expressionscharakteristik von cya- Mutanten. Das zweite Gen, crp , kodiert für ein Protein namens Katabolit-Aktivator-Protein (CAP) oder cAMP-Rezeptor-Protein (CRP).
Die Enzyme des Laktosestoffwechsels werden jedoch in kleinen Mengen in Gegenwart von sowohl Glukose als auch Laktose hergestellt (manchmal als Leaky-Expression bezeichnet), da der LacI-Repressor schnell von der DNA assoziiert/dissoziiert, anstatt fest daran zu binden, was Zeit in Anspruch nehmen kann für RNAP, um mRNAs von lacZYA zu binden und zu transkribieren . Eine undichte Expression ist notwendig, um den Metabolismus von etwas Lactose zu ermöglichen, nachdem die Glucosequelle verbraucht ist, aber bevor die lac- Expression vollständig aktiviert ist.
Zusammenfassend:
- Wenn Laktose fehlt, gibt es nur sehr wenig Lac-Enzymproduktion (der Operator hat daran gebundenen Lac-Repressor).
- Wenn Laktose vorhanden ist, aber auch eine bevorzugte Kohlenstoffquelle (wie Glukose) vorhanden ist, wird eine kleine Menge Enzym produziert (der Lac-Repressor ist nicht an den Operator gebunden).
- Wenn Glucose fehlt, bindet CAP-cAMP an eine spezifische DNA-Stelle stromaufwärts des Promotors und führt eine direkte Protein-Protein-Interaktion mit RNAP ein, die die Bindung von RNAP an den Promotor erleichtert.
Die Verzögerung zwischen den Wachstumsphasen spiegelt die Zeit wider, die benötigt wird, um ausreichende Mengen an Lactose-metabolisierenden Enzymen zu produzieren. Zuerst muss sich das CAP-regulatorische Protein auf dem lac- Promotor zusammensetzen, was zu einer Erhöhung der Produktion von lac- mRNA führt . Mehr verfügbare Kopien der lac- mRNA führen zur Produktion (siehe Übersetzung ) von deutlich mehr Kopien von LacZ (β-Galactosidase, für den Laktosestoffwechsel) und LacY (Laktosepermease zum Transport von Laktose in die Zelle). Nach einer Verzögerung, die erforderlich ist, um den Spiegel der Lactose-metabolisierenden Enzyme zu erhöhen, treten die Bakterien in eine neue schnelle Phase des Zellwachstums ein .
Zwei Rätsel der Katabolitrepression beziehen sich darauf, wie der cAMP-Spiegel an die Anwesenheit von Glukose gekoppelt ist, und zweitens, warum sich die Zellen überhaupt die Mühe machen sollten. Nachdem Laktose gespalten wurde, bildet sie tatsächlich Glukose und Galaktose (die leicht in Glukose umgewandelt wird). Im Stoffwechsel ist Laktose ein ebenso guter Kohlenstoff- und Energielieferant wie Glukose. Der cAMP-Spiegel hängt nicht mit der intrazellulären Glucosekonzentration zusammen, sondern mit der Geschwindigkeit des Glucosetransports, der die Aktivität der Adenylatcyclase beeinflusst. (Außerdem führt der Glukosetransport auch zu einer direkten Hemmung der Laktosepermease.) Warum E. coli so funktioniert, kann nur spekuliert werden. Alle Darmbakterien fermentieren Glukose, was darauf hindeutet, dass sie häufig darauf stoßen. Es ist möglich, dass ein kleiner Unterschied in der Transport- oder Metabolisierungseffizienz von Glucose gegenüber Lactose es für Zellen vorteilhaft macht, das lac- Operon auf diese Weise zu regulieren .
Anwendung in der Molekularbiologie
Das lac- Gen und seine Derivate können als Reportergen in einer Reihe von Selektionstechniken auf Bakterienbasis verwendet werden, wie z. B. der Zwei-Hybrid- Analyse, bei der die erfolgreiche Bindung eines Transkriptionsaktivators an eine spezifische Promotorsequenz bestimmt werden muss. In LB- Platten, die X-gal enthalten , entspricht die Farbänderung von weißen Kolonien zu einem Blauton etwa 20–100 β-Galactosidase-Einheiten, während Tetrazolium- Lactose- und MacConkey-Lactose-Medien einen Bereich von 100–1000 Einheiten aufweisen und am empfindlichsten sind die oberen und unteren Teile dieses Bereichs. Da MacConkey-Laktose- und Tetrazolium-Laktose-Medien beide auf die Produkte des Laktoseabbaus angewiesen sind, erfordern sie die Anwesenheit sowohl des lacZ- als auch des lacY- Gens. Die vielen lac- Fusionstechniken, die nur das lacZ- Gen umfassen, sind somit für X-gal-Platten oder ONPG- Flüssigbrühen geeignet .
Siehe auch
Verweise
Externe Links
- Lac+Operon an der US National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH)
- lac- Operon im NCBI-Bücherregal [2]
- Virtual Cell Animation Collection Einführung: Das Lac Operon
- Das Lac Operon: Bozeman Science
- Färbung ganzer Mausembryonen auf β-Galactosidase (lacZ)-Aktivität