Lysozym - Lysozyme

Glykosidhydrolase, Familie 22, Lysozym
Lysozymecrystals1.png
Bezeichner
Symbol ?
InterPro IPR000974
Lysozym
Bezeichner
EG-Nr. 3.2.1.17
CAS-Nr. 9001-63-2
Datenbanken
IntEnz IntEnz-Ansicht
BRENDA BRENDA-Eintrag
ExPASy NiceZyme-Ansicht
KEGG KEGG-Eintrag
MetaCyc Stoffwechselweg
PRIAM Profil
PDB- Strukturen RCSB PDB PDBe PDBsum
Gen-Ontologie AmiGO / QuickGO

Lysozym , auch bekannt als Muramidase oder N-Acetylmuramid-Glykanhydrolase , ist ein antimikrobielles Enzym, das von Tieren produziert wird und Teil des angeborenen Immunsystems ist . Lysozym ist eine Glykosidhydrolase , die die Hydrolyse von 1,4-Beta-Bindungen zwischen N-Acetylmuraminsäure und N-Acetyl-D-Glucosamin- Resten in Peptidoglycan katalysiert , dem Hauptbestandteil der grampositiven Bakterienzellwand . Diese Hydrolyse beeinträchtigt wiederum die Integrität der Bakterienzellwände, was zur Lyse der Bakterien führt.

Lysozym ist reichlich in Sekreten einschließlich Tränen , Speichel , Muttermilch und Schleim enthalten . Es ist auch in zytoplasmatischen Granula der Makrophagen und den polymorphkernigen Neutrophilen (PMNs) vorhanden. Im Eiweiß sind große Mengen Lysozym enthalten . C-Typ-Lysozymen sind in Sequenz und Struktur eng mit Alpha-Lactalbumin verwandt , was sie zu einem Teil derselben Glycosidhydrolase-Familie macht 22 . Beim Menschen wird das C-Typ-Lysozym-Enzym vom LYZ- Gen kodiert.

Hühnereiweiß-Lysozym ist thermisch stabil und hat einen Schmelzpunkt von bis zu 72 °C bei pH 5,0. Lysozym in der Muttermilch verliert jedoch bei dieser Temperatur sehr schnell an Aktivität. Hühnereiweiß-Lysozym behält seine Aktivität in einem großen pH-Bereich (6-9). Sein isoelektrischer Punkt beträgt 11,35. Der isoelektrische Punkt von Muttermilch-Lysozym beträgt 10,5-11.

Funktion und Mechanismus

Das Enzym funktioniert, indem es glycosidische Bindungen in Peptidoglycanen hydrolysiert . Das Enzym kann auch glycosidische Bindungen in Chitin brechen , wenn auch nicht so effektiv wie echte Chitinasen .

Übersicht über die lysozymkatalysierte Reaktion

Das aktive Zentrum von Lysozym bindet das Peptidoglycan- Molekül in der prominenten Spalte zwischen seinen beiden Domänen. Es greift Peptidoglykane an (die in den Zellwänden von Bakterien, insbesondere Gram-positiven Bakterien vorkommen ), sein natürliches Substrat, zwischen N- Acetylmuraminsäure (NAM) und dem vierten Kohlenstoffatom von N-Acetylglucosamin (NAG).

Kürzere Saccharide wie Tetrasaccharide haben sich ebenfalls als lebensfähige Substrate erwiesen, jedoch über ein Zwischenprodukt mit einer längeren Kette. Chitin hat sich auch als lebensfähiges Lysozym-Substrat erwiesen. Künstliche Substrate wurden ebenfalls entwickelt und in Lysozym verwendet.

Mechanismus

Phillips

Der Phillips-Mechanismus schlug vor, dass die katalytische Kraft des Enzyms sowohl von der sterischen Spannung des gebundenen Substrats als auch von der elektrostatischen Stabilisierung einer Oxo-Carbenium- Zwischenstufe stammt. Aus röntgenkristallographischen Daten schlug Phillips das aktive Zentrum des Enzyms vor, an dem ein Hexasaccharid bindet. Das Lysozym verzerrt den vierten Zucker (in der D- oder -1-Unterstelle) im Hexasaccharid in eine Halbsessel-Konformation. In diesem belasteten Zustand wird die glykosidische Bindung leichter gebrochen. Als Ergebnis des glycosidischen Bindungsbruchs entsteht ein ionisches Zwischenprodukt, das ein Oxo-Carbenium enthält . Eine Verzerrung, die bewirkt, dass das Substratmolekül eine gespannte Konformation ähnlich der des Übergangszustands annimmt, senkt die Energiebarriere der Reaktion.

Das vorgeschlagene Oxo-Carbonium-Intermediat wurde 1978 von Arieh Warshel als elektrostatisch durch Aspartat- und Glutamat-Reste im aktiven Zentrum stabilisiert der Ladungswechselwirkung. In Warshel Modell, wirkt das Enzym als super-Lösungsmittel, die die Orientierung von Ionenpaaren fixiert und bietet super- Solvatation (sehr gute Stabilisierung von Ionenpaaren) und insbesondere die Energie senken , wenn zwei Ionen nahe beieinander sind.

Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt (RDS) in diesem Mechanismus hängt mit der Bildung des Oxo-Carbenium- Zwischenprodukts zusammen. Es gab einige widersprüchliche Ergebnisse, um den genauen RDS anzugeben. Durch die Verfolgung der Produktbildung ( p-Nitrophenol ) wurde entdeckt, dass sich der RDS bei unterschiedlichen Temperaturen ändern kann, was ein Grund für diese widersprüchlichen Ergebnisse war. Bei einer höheren Temperatur ist das RDS die Bildung des Glycosylenzym-Zwischenprodukts und bei einer niedrigeren Temperatur der Abbau dieses Zwischenprodukts.

Kovalentes Intermediat des Lysozym-Enzyms, mit kovalenter Bindung in Schwarz und experimentellem Nachweis als blaues Netz.

Koshland

Substrate in Vocadlos Experiment

In einer frühen Debatte im Jahr 1969 schlug Dahlquist einen kovalenten Mechanismus für Lysozym basierend auf einem kinetischen Isotopeneffekt vor , aber lange Zeit wurde der ionische Mechanismus mehr akzeptiert. 2001 schlug Vocadlo einen revidierten Mechanismus über ein kovalentes, aber nicht ionisches Intermediat vor. Evidence from ESI - MS - Analyse zeigte eine kovalente Zwischenprodukt. Ein 2-Fluor-substituiertes Substrat wurde verwendet, um die Reaktionsgeschwindigkeit zu verringern und ein Zwischenprodukt zur Charakterisierung anzureichern. Es wurde festgestellt, dass die Aminosäureseitenketten Glutaminsäure 35 (Glu35) und Aspartat 52 (Asp52) für die Aktivität dieses Enzyms entscheidend sind. Glu35 fungiert als Protonendonor für die glycosidische Bindung und spaltet die CO-Bindung im Substrat, während Asp52 als Nukleophil fungiert , um ein Glycosylenzym-Zwischenprodukt zu erzeugen. Das Glu35 reagiert mit Wasser unter Bildung von Hydroxylionen, einem stärkeren Nukleophil als Wasser, das dann das Glycosylenzym-Zwischenprodukt angreift, um das Hydrolyseprodukt zu ergeben und das Enzym unverändert zu lassen. Dieser kovalente Mechanismus wurde nach Koshland benannt , der diesen Mechanismus zuerst vorschlug.

In jüngerer Zeit, Quantenmechanik / Molekülmechanik (QM / MM) Molekulardynamik - Simulationen den Kristall von HEWL und vorhersagen Zwischen der Existenz einer kovalenten verwendet haben. Beweise für die ESI-MS- und Röntgenstruktur weisen auf die Existenz eines kovalenten Zwischenprodukts hin, beruhen jedoch hauptsächlich auf der Verwendung eines weniger aktiven mutierten oder nicht-nativen Substrats. Somit bietet die QM/MM-Moleküldynamik die einzigartige Möglichkeit, den Mechanismus von Wildtyp-HEWL und nativem Substrat direkt zu untersuchen. Die Berechnungen ergaben, dass das kovalente Intermediat des Koshland-Mechanismus ~30 kcal/mol stabiler ist als das ionische Intermediat des Phillips-Mechanismus. Diese Rechnungen zeigen, dass die ionische Zwischenstufe energetisch extrem ungünstig ist und die kovalenten Zwischenstufen, die in Experimenten mit weniger aktiven mutierten oder nicht-nativen Substraten beobachtet wurden, geben nützliche Einblicke in den Mechanismus von Wildtyp-HEWL.

Zwei mögliche Mechanismen von Lysozym

Hemmung

Imidazol- Derivate können mit einigen Resten (innerhalb oder außerhalb des aktiven Zentrums) einen Charge-Transfer-Komplex bilden , um eine kompetitive Hemmung von Lysozym zu erreichen. In Gram-negativen Bakterien wirkt das Lipopolysaccharid als nicht-kompetitiver Inhibitor durch eine stark begünstigte Bindung mit Lysozym.

Nicht-enzymatische Wirkung

Obwohl angenommen wurde, dass die Muramidase-Aktivität von Lysozym die Schlüsselrolle für seine antibakteriellen Eigenschaften spielt, wurde auch über seine nicht-enzymatische Wirkung berichtet. Zum Beispiel beseitigt das Blockieren der katalytischen Aktivität von Lysozym durch Mutation der kritischen Aminosäure im aktiven Zentrum (52- Asp -> 52- Ser ) seine antimikrobielle Aktivität nicht. Die lektinähnliche Fähigkeit von Lysozym, bakterielles Kohlenhydratantigen ohne lytische Aktivität zu erkennen, wurde für Tetrasaccharide berichtet, die mit Lipopolysacchariden von Klebsiella pneumoniae verwandt sind . Außerdem interagiert Lysozym mit Antikörpern und T-Zell-Rezeptoren .

Änderungen der Enzymkonformation

Lysozym weist zwei Konformationen auf: einen offenen aktiven Zustand und einen geschlossenen inaktiven Zustand. Die katalytische Relevanz wurde mit Single Walled Carbon Nanotubes (SWCN)-Feldeffekttransistoren (FETs) untersucht, bei denen ein einzelnes Lysozym an den SWCN-FET gebunden war. Die elektronische Überwachung des Lysozyms zeigte zwei Konformationen, ein offenes aktives Zentrum und ein geschlossenes inaktives Zentrum. In seinem aktiven Zustand ist Lysozym in der Lage, sein Substrat prozessiv zu hydrolysieren und bricht durchschnittlich 100 Bindungen mit einer Geschwindigkeit von 15 pro Sekunde. Um ein neues Substrat zu binden und vom geschlossenen inaktiven Zustand in den offenen aktiven Zustand zu gelangen, sind zwei Konformationsstufenänderungen erforderlich, während die Inaktivierung einen Schritt erfordert.

Rolle bei Krankheit und Therapie

LYZ
Verfügbare Strukturen
PDB Orthologsuche: PDBe RCSB
Bezeichner
Aliase LYZ , LZM, LYZF1, Lysozym
Externe IDs OMIM : 153450 MGI : 96902 Homologene : 121490 Genecards : LYZ
Orthologe
Spezies Menschlich Maus
Entrez
Ensemble
UniProt
RefSeq (mRNA)

NM_000239

NM_013590

RefSeq (Protein)

NP_000230

NP_038618

Standort (UCSC) Chr 12: 69,35 – 69,35 Mb Chr 10: 117,29 – 117,29 Mb
PubMed- Suche
Wikidata
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Lysozym ist Teil des angeborenen Immunsystems. Reduzierte Lysozymspiegel wurden bei Neugeborenen mit bronchopulmonaler Dysplasie in Verbindung gebracht. Ferkel, die mit menschlicher Lysozymmilch gefüttert werden, können sich schneller von einer durch E. coli verursachten Durchfallerkrankung erholen . Die Konzentration von Lysozym in der Muttermilch ist 1.600- bis 3.000-mal höher als die Konzentration in der Milch von Nutztieren. Menschliches Lysozym ist aktiver als Hühnereiweiß-Lysozym. Eine transgene Ziegenlinie (mit einem Gründer namens "Artemis") wurde entwickelt, um Milch mit menschlichem Lysozym zu produzieren, um Kinder vor Durchfall zu schützen, wenn sie die Vorteile des menschlichen Stillens nicht nutzen können.

Da Lysozym ein natürlicher Schutz vor grampositiven Krankheitserregern wie Bacillus und Streptococcus ist , spielt es eine wichtige Rolle in der Immunologie von Säuglingen bei der Muttermilchernährung. Während die Haut aufgrund ihrer Trockenheit und Säure eine Schutzbarriere darstellt, wird die Bindehaut (Membran, die das Auge bedeckt) stattdessen durch sezernierte Enzyme, hauptsächlich Lysozym und Defensin , geschützt . Wenn diese Schutzbarrieren jedoch versagen, kommt es zu einer Bindehautentzündung .

Bei bestimmten Krebsarten (insbesondere myelomonozytäre Leukämie) kann eine übermäßige Produktion von Lysozym durch Krebszellen zu toxischen Lysozymspiegeln im Blut führen. Hohe Lysozym-Blutspiegel können zu Nierenversagen und zu niedrigem Kalium im Blut führen, Zustände, die sich mit der Behandlung der primären Malignität verbessern oder abklingen können.

Serum-Lysozym ist viel weniger spezifisch für die Diagnose von Sarkoidose als Serum-Angiotensin-Converting-Enzym; Da es jedoch empfindlicher ist, wird es als Marker für die Sarkoidose-Krankheitsaktivität verwendet und eignet sich in nachgewiesenen Fällen zur Krankheitsüberwachung.

Chemische Synthese

Die erste chemische Synthese eines Lysozym-Proteins wurde von Prof. George W. Kenner und seiner Gruppe an der University of Liverpool in England versucht. Dies gelang schließlich 2007 Thomas Durek im Labor von Steve Kent an der University of Chicago, der ein synthetisches funktionelles Lysozym-Molekül herstellte.

Andere Anwendungen

Lysozymkristalle wurden verwendet, um andere funktionelle Materialien für die Katalyse und biomedizinische Anwendungen zu züchten. Lysozym ist ein häufig verwendetes Enzym zur Lyse grampositiver Bakterien. Aufgrund der einzigartigen Funktion von Lysozym, die Zellwand zu verdauen und einen osmotischen Schock zu verursachen (die Zelle platzt durch plötzliche Änderung der Konzentration des gelösten Stoffes um die Zelle und damit des osmotischen Drucks ), wird Lysozym häufig in Laborumgebungen verwendet, um Proteine ​​aus Bakterien freizusetzen Periplasma, während die innere Membran als Vesikel verschlossen bleibt, die als Sphäroplasten bezeichnet werden .

Zum Beispiel kann E. coli unter Verwendung von Lysozym lysiert werden, um den Inhalt des periplasmatischen Raums freizugeben . Es ist besonders nützlich in Laborumgebungen, um zu versuchen, den Inhalt des Periplasmas zu sammeln. Die Lysozym-Behandlung ist bei bestimmten Temperaturen, pH-Bereichen und Salzkonzentrationen optimal. Die Lysozym-Aktivität nimmt mit steigenden Temperaturen bis zu 60 Grad Celsius bei einem pH-Bereich von 6,0-7,0 zu. Die vorhandenen Salze beeinflussen auch die Lysozym-Behandlung, wobei einige hemmende Wirkungen geltend machen und andere die Lyse durch Lysozym-Behandlung fördern. Natriumchlorid induziert Lyse, aber in hohen Konzentrationen ist es ein aktiver Lysehemmer. Ähnliche Beobachtungen wurden bei der Verwendung von Kaliumsalzen beobachtet. Aufgrund von Unterschieden in den Bakterienstämmen sind leichte Abweichungen vorhanden.

Geschichte

Die antibakterielle Eigenschaft von Hühnereiweiß aufgrund des enthaltenen Lysozyms wurde erstmals 1909 von Laschtschenko beobachtet. Die bakterienabtötende Wirkung von Nasenschleim wurde 1922 von Alexander Fleming , dem Entdecker des Penicillins , der den Begriff Lysozym prägte, nachgewiesen. Fleming berichtete und sagte. "Da diese Substanz Eigenschaften hat, die denen von Fermenten ähneln, habe ich sie 'Lysozym' genannt." Fleming zeigte weiter, dass eine enzymatische Substanz in einer Vielzahl von Sekreten vorhanden ist und in der Lage ist, verschiedene Bakterien, insbesondere einen von ihm untersuchten gelben "Kokken", schnell zu lysieren (dh aufzulösen).

Lysozym wurde erstmals 1937 von Edward Abraham kristallisiert , wodurch die dreidimensionale Struktur von Hühnereiweiß-Lysozym von David Chilton Phillips im Jahr 1965 beschrieben werden konnte, als er das erste Modell mit einer Auflösung von 2 ångström (200 pm ) mittels Röntgenkristallographie erhielt . Die Struktur wurde 1965 bei einer Vorlesung der Royal Institution öffentlich präsentiert . Lysozym war die zweite Proteinstruktur und die erste Enzymstruktur, die durch Röntgenbeugungsmethoden gelöst wurde, und das erste vollständig sequenzierte Enzym, das alle zwanzig gängigen Aminosäuren enthält. Als Ergebnis der Aufklärung der Struktur von Lysozym durch Phillips war es auch das erste Enzym, dem ein detaillierter spezifischer Mechanismus für seine katalytische Wirkungsweise vorgeschlagen wurde. Diese Arbeit führte dazu, dass Phillips eine Erklärung dafür lieferte, wie Enzyme eine chemische Reaktion in Bezug auf ihre physikalischen Strukturen beschleunigen. Der von Phillips vorgeschlagene ursprüngliche Mechanismus wurde vor kurzem überarbeitet.

Siehe auch

Verweise

Externe Links