Makromolekulares Crowding - Macromolecular crowding

Makromolekulares Crowding im Zytosol von Zellen verändert die Eigenschaften von Makromolekülen wie Proteinen und Nukleinsäuren .

Das Phänomen des makromolekularen Crowding verändert die Eigenschaften von Molekülen in einer Lösung, wenn hohe Konzentrationen von Makromolekülen wie Proteinen vorhanden sind. Solche Zustände treten routinemäßig in lebenden Zellen auf ; So enthält das Zytosol von Escherichia coli etwa 300–400  mg/ml Makromoleküle. Eine Verdrängung tritt auf, da diese hohen Konzentrationen von Makromolekülen das Volumen des für andere Moleküle in der Lösung verfügbaren Lösungsmittels verringern , was zu einer Erhöhung ihrer effektiven Konzentrationen führt. Die Verdrängung kann die Bildung eines biomolekularen Kondensats durch kolloidale Phasentrennung fördern .

Dieser Crowding-Effekt kann dazu führen, dass sich Moleküle in Zellen radikal anders verhalten als in Reagenzglas-Assays. Folglich können Messungen der Eigenschaften von Enzymen oder Stoffwechselvorgängen , die im Labor ( in vitro ) in verdünnten Lösungen durchgeführt werden, um viele Größenordnungen von den tatsächlichen Werten abweichen, die in lebenden Zellen ( in vivo ) beobachtet werden. Das Studium biochemischer Prozesse unter realistischen Crowding-Bedingungen ist sehr wichtig, da diese Bedingungen eine allgegenwärtige Eigenschaft aller Zellen sind und Crowding für das effiziente Funktionieren des Stoffwechsels essentiell sein kann. Tatsächlich haben In-vitro- Studien gezeigt, dass das Crowding die Bindungsstabilität von Proteinen an DNA stark beeinflusst.

Ursache und Wirkung

Das Innere von Zellen ist eine überfüllte Umgebung. Beispielsweise ist eine Escherichia coli- Zelle nur etwa 2 Mikrometer (μm) lang und 0,5 μm im Durchmesser bei einem Zellvolumen von 0,6 – 0,7 μm 3 . Jedoch E. coli können 4.288 verschiedene Arten von Proteinen enthalten bis und etwa 1.000 dieser Typen auf einem ausreichend hohen Niveau erzeugt werden leicht erkannt werden. Dieser Mischung werden verschiedene Formen von RNA und das DNA- Chromosom der Zelle hinzugefügt , was eine Gesamtkonzentration an Makromolekülen zwischen 300 und 400 mg/ml ergibt. Bei Eukaryoten wird das Zellinnere zusätzlich von den Proteinfilamenten , aus denen das Zytoskelett besteht , überfüllt. Dieses Geflecht teilt das Zytosol in ein Netzwerk enger Poren.

Das Volumen des zugänglichen Lösungsmittels (rot) für zwei Moleküle sehr unterschiedlicher Größe (schwarze Kreise) bei hohen Konzentrationen von Makromolekülen (graue Kreise). Die Reduzierung des verfügbaren Volumens erhöht die effektive Konzentration von Makromolekülen.

Diese hohen Konzentrationen an Makromolekülen nehmen einen großen Teil des Zellvolumens ein, wodurch das für andere Makromoleküle verfügbare Lösungsmittelvolumen reduziert wird. Dieser ausgeschlossene Volumeneffekt erhöht die effektive Konzentration von Makromolekülen (erhöht ihre chemische Aktivität ), was wiederum die Geschwindigkeiten und Gleichgewichtskonstanten ihrer Reaktionen verändert. Dieser Effekt verändert insbesondere die Dissoziationskonstanten, indem er die Assoziation von Makromolekülen begünstigt, beispielsweise wenn mehrere Proteine ​​zusammenkommen, um Proteinkomplexe zu bilden , oder wenn DNA-bindende Proteine an ihre Ziele im Genom binden . Crowding kann auch Enzymreaktionen mit kleinen Molekülen beeinflussen, wenn die Reaktion eine große Veränderung der Form des Enzyms beinhaltet.

Die Größe des Crowding-Effekts hängt sowohl von der Molekülmasse als auch von der Form des beteiligten Moleküls ab, obwohl die Masse der Hauptfaktor zu sein scheint – wobei der Effekt bei größeren Molekülen stärker ist. Bemerkenswert ist, dass die Größe des Effekts nicht linear ist, sodass Makromoleküle viel stärker betroffen sind als kleine Moleküle wie Aminosäuren oder einfache Zucker . Makromolekulares Crowding ist daher ein Effekt, den große Moleküle auf die Eigenschaften anderer großer Moleküle ausüben.

Bedeutung

Makromolekulares Crowding ist ein wichtiger Effekt in der Biochemie und Zellbiologie . Zum Beispiel kann die Zunahme der Interaktionsstärke zwischen Proteinen und DNA durch Crowding von entscheidender Bedeutung für Prozesse wie Transkription und DNA-Replikation sein . Es wurde auch vorgeschlagen, dass Crowding an so unterschiedlichen Prozessen wie der Aggregation von Hämoglobin bei Sichelzellenanämie und den Reaktionen von Zellen auf Veränderungen ihres Volumens beteiligt ist.

Die Bedeutung von Crowding bei der Proteinfaltung ist von besonderem Interesse in der Biophysik . Hier kann der Crowding-Effekt den Faltungsprozess beschleunigen, da ein kompakt gefaltetes Protein weniger Volumen einnimmt als eine ungefaltete Proteinkette. Crowding kann jedoch die Ausbeute an korrekt gefaltetem Protein verringern, indem die Proteinaggregation erhöht wird . Crowding kann auch die Wirksamkeit von Chaperon-Proteinen wie GroEL in der Zelle erhöhen , was dieser Verringerung der Faltungseffizienz entgegenwirken könnte. Es wurde auch gezeigt, dass makromolekulare Verdrängung die Proteinfaltungsdynamik sowie die gesamte Proteinform beeinflusst, wobei unterschiedliche Konformationsänderungen von Sekundärstrukturänderungen begleitet werden, was darauf hindeutet, dass durch Verdrängung induzierte Formänderungen für die Proteinfunktion und -fehlfunktion in vivo wichtig sein können.

Ein besonders eindrucksvolles Beispiel für die Bedeutung von Crowding-Effekten sind die Kristalline , die das Innere der Linse ausfüllen . Diese Proteine ​​müssen stabil und in Lösung bleiben, damit die Linse transparent ist; Ausfällung oder Aggregation von Kristallinen verursacht Katarakte . Crystalline sind in extrem hohen Konzentrationen, über 500 mg/ml, in der Linse vorhanden, und bei diesen Konzentrationen sind Verdrängungseffekte sehr stark. Der große Crowding-Effekt trägt zur thermischen Stabilität der Kristalline bei und erhöht ihre Denaturierungsbeständigkeit . Dieser Effekt kann teilweise die außerordentliche Widerstandsfähigkeit der Linse gegenüber Schäden durch hohe Temperaturen erklären.

Lernen

Aufgrund von makromolekularem Engstand können Enzymassays und biophysikalische Messungen, die in verdünnter Lösung durchgeführt werden, den tatsächlichen Prozess und seine Kinetik im Zytosol möglicherweise nicht widerspiegeln. Ein Ansatz für genauere Messungen wäre die Verwendung hochkonzentrierter Zellextrakte, um zu versuchen, den Zellinhalt in einem natürlicheren Zustand zu halten. Solche Extrakte enthalten jedoch viele Arten von biologisch aktiven Molekülen, die die untersuchten Phänomene stören können. Folglich werden Crowding-Effekte in vitro durch Zugabe hoher Konzentrationen relativ inerter Moleküle wie Polyethylenglycol , Ficoll , Dextran oder Serumalbumin zu experimentellen Medien nachgeahmt . Die Verwendung solcher künstlichen Crowding-Agenten kann jedoch kompliziert sein, da diese Crowding-Moleküle manchmal auf andere Weise mit dem untersuchten Prozess interagieren können, beispielsweise durch schwache Bindung an eine der Komponenten.

Makromolekulares Crowding und Proteinfaltung

Eine große Bedeutung des makromolekularen Crowding zu biologischen Systemen rührt von seiner Wirkung auf die Proteinfaltung her . Der zugrunde liegende physikalische Mechanismus, durch den makromolekulares Crowding dazu beiträgt, Proteine ​​in ihrem gefalteten Zustand zu stabilisieren, wird oft mit dem ausgeschlossenen Volumen erklärt – dem Volumen, das den Proteinen aufgrund ihrer Wechselwirkung mit makromolekularen Crowdern nicht zugänglich ist. Diese Vorstellung geht auf Asakura und Oosawa zurück, die Verarmungskräfte beschrieben haben , die durch sterische, harte Kernwechselwirkungen induziert werden. Ein Kennzeichen des oben abgeleiteten Mechanismus ist, dass der Effekt vollständig athermisch und somit vollständig entropisch ist. Diese Ideen wurden auch vorgeschlagen, um zu erklären, warum kleine Cosolute, nämlich schützende Osmolyte , die vorzugsweise von Proteinen ausgeschlossen werden, ebenfalls das Proteinfaltungsgleichgewicht in Richtung des gefalteten Zustands verschieben. Es wurde jedoch durch verschiedene experimentelle und theoretische Methoden gezeigt, dass Verarmungskräfte nicht immer entropischer Natur sind.

Makromolekulares Crowding in der regenerativen Medizin

Satyamet al. von der National University of Ireland, Galway (NUI Galway), schlug makromolekulares Crowding als Mittel vor, um ECM-reiche Gewebeäquivalente zu erzeugen. Das Prinzip des makromolekularen Crowding leitet sich aus der Vorstellung ab, dass sich in vivo- Zellen in einem stark überfüllten/dichten extrazellulären Raum befinden und daher die Umwandlung des de novo synthetisierten Prokollagens in Kollagen I schnell erfolgt. Unter den noch wesentlich verdünnteren als Körperflüssigkeiten (z. B. Urin: 36–50 g/L; Blut: 80 g/L) Kulturbedingungen (z. B. Nährmedium HAM F10: 16,55 g/L; DMEM/F12-Medium: 16,78 g/L; DMEM-Medium mit hohem Glukose- und L-Glutamin-Gehalt: 17,22 g/L) ist die geschwindigkeitsbegrenzende Umwandlung von Prokollagen in Kollagen I sehr langsam. Es wurde bestätigt, dass die Zugabe von inerten polydispersen Makromolekülen (dargestellt als kugelförmige Objekte mit variablem Durchmesser) in den Kulturmedien die verstärkte Produktion von ECM-reichen lebenden Ersatzstoffen erleichtert. Makromolekulares Crowding durch Nachahmen der lokalisierten Dichte des nativen Gewebes kann verwendet werden, um in vitro Mikroumgebungen effektiv zu modulieren und letztendlich ECM-reiche Zellersatzstoffe innerhalb von Stunden statt Tagen oder Monaten in Kultur zu produzieren, ohne grundlegende Zellfunktionen zu beeinträchtigen.

Siehe auch

Verweise

Externe Links