Mikrotom - Microtome

Ein Mikrotom (von griechisch mikros , was "klein" bedeutet, und temnein , was "schneiden" bedeutet) ist ein Schneidwerkzeug, das verwendet wird, um extrem dünne Materialscheiben herzustellen, die als Schnitte bekannt sind . Wichtig in der Wissenschaft sind Mikrotome in verwendet Mikroskopie , so dass für die Vorbereitung von Proben für die Beobachtung unter tragenen Licht oder Elektronenstrahlung.

Mikrotome verwenden Stahl- , Glas- oder Diamantklingen , abhängig von der zu schneidenden Probe und der gewünschten Dicke der zu schneidenden Abschnitte. Stahlklingen werden verwendet, um histologische Schnitte von tierischen oder pflanzlichen Geweben für die Lichtmikroskopie vorzubereiten . Glasmesser werden verwendet, um Schnitte für die Lichtmikroskopie und sehr dünne Schnitte für die Elektronenmikroskopie zu schneiden . Diamantmesser in Industriequalität werden zum Schneiden von harten Materialien wie Knochen , Zähnen und zähem Pflanzenmaterial sowohl für die Lichtmikroskopie als auch für die Elektronenmikroskopie verwendet. Diamantmesser in Edelsteinqualität werden auch zum Schneiden von Dünnschliffen für die Elektronenmikroskopie verwendet .

Die Mikrotomie ist eine Methode zur Herstellung von Dünnschliffen für Materialien wie Knochen, Mineralien und Zähne und eine Alternative zum Elektropolieren und Ionenfräsen . Mikrotomschnitte können dünn genug gemacht werden, um ein menschliches Haar über seine Breite zu schneiden, mit Schnittdicken zwischen 50  nm und 100  µm .

Geschichte

Ein Diagramm eines Mikrotoms, das 1770 von Cummings gezeichnet wurde.

In den Anfängen der Lichtmikroskop- Entwicklung wurden Schnitte von Pflanzen und Tieren manuell mit Rasierklingen angefertigt. Es wurde festgestellt, dass es zur Beobachtung der Struktur der zu beobachtenden Probe wichtig ist, saubere reproduzierbare Schnitte in der Größenordnung von 100 &mgr;m zu machen, durch die Licht übertragen werden kann. Dies ermöglichte die Beobachtung von Proben unter Verwendung von Lichtmikroskopen im Transmissionsmodus.

Eines der ersten Geräte zur Herstellung solcher Schnitte wurde 1770 von George Adams, Jr. (1750–1795) erfunden und von Alexander Cummings weiterentwickelt . Die Vorrichtung wurde handbetätigt und die Probe in einem Zylinder gehalten und Schnitte von der Oberseite der Probe mit einer Handkurbel erstellt.

Im Jahr 1835 entwickelte Andrew Prichard ein tischbasiertes Modell, das es ermöglichte, die Vibration zu isolieren, indem das Gerät am Tisch befestigt und der Bediener vom Messer getrennt wurde.

Gelegentlich Zuschreibung für die Erfindung des Mikrotom zu dem Anatomen gegeben Wilhelm His, Sr. (1865), in seiner Beschreibung Eines Mikrotoms (deutsch für Beschreibung eines Mikrotom ), Wilhelm schrieb:

Der Apparat hat eine Präzision in der Arbeit ermöglicht, mit der ich Schnitte erzielen kann, die ich mit der Hand unmöglich herstellen kann. Es hat nämlich die Möglichkeit ermöglicht, im Zuge der Forschung ununterbrochene Schnitte von Objekten zu erzielen.

Andere Quellen schreiben die Entwicklung außerdem dem tschechischen Physiologen Jan Evangelista Purkyně zu . Mehrere Quellen beschreiben das Purkyne-Modell als das erste im praktischen Einsatz.

Die Unklarheiten über die Ursprünge des Mikrotoms sind darauf zurückzuführen, dass die ersten Mikrotome einfach Schneidegeräte waren und die Entwicklungsphase früher Geräte weitgehend undokumentiert ist.

Ende des 19. Jahrhunderts ermöglichte die Entwicklung sehr dünner und konstant dünner Proben durch Mikrotomie zusammen mit der selektiven Färbung wichtiger Zellbestandteile oder Moleküle die Visualisierung von Mikroskopdetails.

Heutzutage sind die meisten Mikrotome in Messerblockbauweise mit einem auswechselbaren Messer, einem Probenhalter und einem Vorschubmechanismus ausgestattet. Bei den meisten Geräten beginnt das Schneiden der Probe, indem die Probe über das Messer bewegt wird, wobei sich der Vorschubmechanismus automatisch vorwärts bewegt, so dass der nächste Schnitt für eine gewählte Dicke durchgeführt werden kann. Die Schnittdicke wird durch einen Einstellmechanismus gesteuert, der eine präzise Steuerung ermöglicht.

Anwendungen

Mikrotom (C. Reichert, Wien, 1905–1915).

Die häufigsten Anwendungen von Mikrotomen sind:

  • Traditionelle Histologie- Technik: Das Gewebe wird fixiert, dehydriert, gereinigt und in geschmolzenes Paraffin eingebettet , das beim Abkühlen einen festen Block bildet. Anschließend wird das Gewebe im Mikrotom in Dicken von 2 bis 50 µm geschnitten. Von dort kann das Gewebe auf einen Objektträger aufgezogen, nach Entfernung des Paraffins mit einem oder mehreren geeigneten wässrigen Farbstoffen gefärbt und unter einem Lichtmikroskop untersucht werden.
  • Schnellschnittverfahren : wasserreiche Gewebe durch Gefrieren und Schnitt im gefrorenen Zustand mit einem Gefriermikrotom oder microtome- gehärtet sind Kryostaten ; Schnitte werden gefärbt und mit einem Lichtmikroskop untersucht. Diese Technik ist viel schneller als die herkömmliche Histologie (5 Minuten vs. 16 Stunden) und wird in Verbindung mit medizinischen Verfahren verwendet, um eine schnelle Diagnose zu erhalten. Kryoschnitte können auch in der Immunhistochemie verwendet werden, da das Einfrieren von Gewebe den Gewebeabbau schneller stoppt als die Verwendung eines Fixiermittels und seine chemische Zusammensetzung nicht so stark verändert oder maskiert.
  • Elektronenmikroskopie- Technik: Nach dem Einbetten des Gewebes in Epoxidharz wird ein Mikrotom, das mit einem Glas- oder Edelstein-Diamantmesser ausgestattet ist, verwendet, um sehr dünne Schnitte (typischerweise 60 bis 100 Nanometer) zu schneiden. Die Schnitte werden mit einer wässrigen Lösung eines geeigneten Schwermetallsalzes gefärbt und mit einem Transmissionselektronenmikroskop untersucht . Dieses Instrument wird oft als Ultramikrotom bezeichnet . Das Ultramikrotom wird auch mit seinem Glasmesser oder einem Diamantmesser in Industriequalität verwendet, um Vermessungsabschnitte vor dem Dünnschnitt zu schneiden. Diese Übersichtsschnitte sind im Allgemeinen 0,5 bis 1 &mgr;m dick und werden auf einen Glasobjektträger montiert und gefärbt, um interessierende Bereiche unter einem Lichtmikroskop zu lokalisieren, bevor für das TEM dünne Schnitte durchgeführt werden. Dünnschnitte für das TEM werden oft mit einem Diamantmesser in Edelsteinqualität durchgeführt. Ergänzend zu traditionellen TEM-Techniken werden Ultramikrotome zunehmend in einer REM-Kammer montiert, damit die Oberfläche der Blockfläche abgebildet und dann mit dem Mikrotom entfernt werden kann, um die nächste Oberfläche für die Bildgebung freizulegen. Diese Technik wird Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBFSEM) genannt.
  • Botanische Mikrotomie-Technik: Harte Materialien wie Holz, Knochen und Leder erfordern ein Schlittenmikrotom . Diese Mikrotome haben schwerere Klingen und können nicht so dünn wie ein normales Mikrotom schneiden.
  • Spektroskopie (insbesondere FTIR- oder Infrarot-Spektroskopie ) Technik: Es werden dünne Polymerschnitte benötigt, damit der Infrarotstrahl die zu untersuchende Probe durchdringt. Es ist normal, Proben auf eine Dicke zwischen 20 und 100 µm zu schneiden. Für eine detailliertere Analyse von viel kleineren Bereichen in einem Dünnschliff kann die FTIR- Mikroskopie zur Probeninspektion verwendet werden.

Eine neuere Entwicklung ist das Lasermikrotom , das die Zielprobe mit einem Femtosekundenlaser statt mit einem mechanischen Messer schneidet. Diese Methode ist berührungslos und erfordert keine Probenvorbereitungstechniken. Das Lasermikrotom hat die Fähigkeit, fast jedes Gewebe in seinem nativen Zustand zu schneiden. Je nach zu bearbeitendem Material sind Schichtdicken von 10 bis 100 µm realisierbar.

Die Schnittintervalle können hauptsächlich unterteilt werden in:

  • Serielles Schneiden: Erhalten eines kontinuierlichen Bandes von Schnitten aus einem Paraffinblock und Verwendung aller für Objektträger.
  • Stufenabschnitte: in bestimmten Tiefen im Block gesammelt.

Typen

Schlitten

Ein Schlittenmikrotom

Ein Schlittenmikrotom ist ein Gerät, bei dem die Probe in einen festen Halter (Shuttle) gelegt wird, der sich dann über ein Messer hin und her bewegt. Bei modernen Schlittenmikrotomen ist der Schlitten auf einem Linearlager platziert, ein Design, das es dem Mikrotom ermöglicht, viele grobe Schnitte problemlos zu schneiden. Durch Einstellen der Winkel zwischen Probe und Mikrotommesser kann der auf die Probe beim Schneiden ausgeübte Druck reduziert werden. Typische Anwendungen für dieses Mikrotomdesign sind die Vorbereitung großer Proben, wie sie in Paraffin für biologische Präparate eingebettet sind. Eine typische Schnittdicke, die auf einem Schlittenmikrotom erreichbar ist, liegt zwischen 1 und 60 µm.

Rotary

Ein Rotationsmikrotom älterer Bauart

Dieses Instrument ist ein übliches Mikrotom-Design. Dieses Gerät arbeitet mit einer abgestuften Drehbewegung, so dass das eigentliche Schneiden Teil der Drehbewegung ist. Bei einem Rotationsmikrotom wird das Messer typischerweise in einer horizontalen Position fixiert.

Prinzip der Probenbewegung für einen Schnitt auf einem Rotationsmikrotom

In der Abbildung links wird das Prinzip des Schnitts erklärt. Durch die Bewegung des Probenhalters wird die Probe von Messerposition 1 auf Position 2 geschnitten, wobei der frische Schnitt auf dem Messer verbleibt. Am höchsten Punkt der Drehbewegung wird der Probenhalter um die gleiche Dicke wie der zu erstellende Schnitt vorgeschoben, so dass der nächste Schnitt erstellt werden kann.

Bei vielen Mikrotomen kann das Schwungrad von Hand bedient werden. Dies hat den Vorteil, dass ein sauberer Schnitt erfolgen kann, da die relativ große Masse des Schwungrades ein Anhalten der Probe während des Probenschnitts verhindert. Bei neueren Modellen ist das Schwungrad oft in das Mikrotomgehäuse integriert. Die typische Schnittdicke für ein Rotationsmikrotom liegt zwischen 1 und 60 µm. Bei harten Materialien, wie beispielsweise einer in Kunstharz eingebetteten Probe, kann diese Mikrotombauform gute "halbdünne" Schnitte mit einer Dicke von nur 0,5 µm ermöglichen.

Kryomikrotom

Ein Kryomikrotom

Für das Schneiden von gefrorenen Proben können viele Rotationsmikrotome so angepasst werden, dass sie in einer Flüssig-Stickstoff-Kammer in einem sogenannten Kryomikrotom-Aufbau schneiden. Durch die reduzierte Temperatur kann die Härte der Probe erhöht werden, beispielsweise durch einen Glasübergang, der die Herstellung halbdünner Proben ermöglicht. Jedoch müssen die Probentemperatur und die Messertemperatur kontrolliert werden, um die resultierende Probendicke zu optimieren.

Ultramikrotom

Ein Band ultradünner Schnitte, das durch Ultramikrotomie bei Raumtemperatur hergestellt wurde und auf dem Wasser im Boot eines Diamantmessers schwimmt, das zum Schneiden der Schnitte verwendet wird. Die Messerklinge ist die Kante am oberen Ende der Wasserwanne.

Ein Ultramikrotom ist ein Hauptwerkzeug der Ultramikrotomie . Es ermöglicht die Herstellung extrem dünner Schnitte, wobei das Gerät wie ein Rotationsmikrotom funktioniert, jedoch mit sehr engen Toleranzen bei der mechanischen Konstruktion. Durch die sorgfältige mechanische Konstruktion wird die lineare Wärmeausdehnung der Halterung genutzt, um die Dicke sehr fein zu steuern.

Diese extrem dünnen Schnitte sind wichtig für die Verwendung mit dem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) und der seriellen Blockflächen -Rasterelektronenmikroskopie (SBFSEM) und manchmal auch für die lichtoptische Mikroskopie. Die typische Dicke dieser Schnitte liegt zwischen 40 und 100 nm für die Transmissionselektronenmikroskopie und oft zwischen 30 und 50 nm für SBFSEM. Dickere Schnitte mit einer Dicke von bis zu 500 nm werden auch für spezielle TEM-Anwendungen oder für lichtmikroskopische Vermessungsschnitte genommen, um einen Bereich für die endgültigen Dünnschnitte auszuwählen. Diamantmesser (vorzugsweise) und Glasmesser werden mit Ultramikrotomen verwendet. Um die Schnitte zu sammeln, werden sie während des Schneidens auf einer Flüssigkeit geschwommen und vorsichtig auf Gittern aufgenommen, die für die Betrachtung von TEM-Proben geeignet sind. Die Dicke des Schnitts lässt sich anhand der Dünnfilm-Interferenzfarben des reflektierten Lichts abschätzen, die aufgrund der extrem geringen Probendicke sichtbar sind.

Vibrieren

Das vibrierende Mikrotom arbeitet durch Schneiden unter Verwendung einer vibrierenden Klinge, wodurch der resultierende Schnitt mit weniger Druck ausgeführt werden kann, als dies für eine stationäre Klinge erforderlich wäre. Das Vibrationsmikrotom wird normalerweise für schwierige biologische Proben verwendet. Die Schnittdicke beträgt in der Regel 30–500 µm für lebendes Gewebe und 10–500 µm für fixiertes Gewebe.

Eine Variation des Vibrationsmikrotoms ist das Compresstome-Mikrotom. Das Compresstome verwendet eine Probenspritze oder ein "lippenstiftähnliches" Röhrchen, um das Gewebe zu halten. Die Gewebeprobe wird vollständig in Agarose (ein Polysaccharid ) eingebettet und das Gewebe wird langsam und sanft aus dem Röhrchen gedrückt, damit die vibrierende Klinge geschnitten wird. Das Gerät funktioniert wie folgt: Das Ende des Probenröhrchens, an dem das Gewebe austritt, ist etwas schmaler als das Ladeende, was eine sanfte "Kompression" des Gewebes beim Austritt aus dem Röhrchen ermöglicht. Die leichte Kompression verhindert, dass Scheren, ungleichmäßiges Schneiden und Vibrationsartefakte entstehen. Beachten Sie, dass die Kompressionstechnologie das zu schneidende Gewebe nicht beschädigt oder beeinträchtigt.

Das Compresstome-Mikrotom bietet mehrere Vorteile: 1) Die Agarose-Einbettung verleiht der gesamten Probe von allen Seiten Stabilität, wodurch ein ungleichmäßiges Aufschneiden oder Abscheren des Gewebes verhindert wird; 2) die Kompressionstechnologie komprimiert das Gewebe sanft für ein gleichmäßiges Schneiden, so dass die Klinge nicht gegen das Gewebe drückt; 3) schnelleres Schneiden als die meisten vibrierenden Mikrotome; und 4) es schneidet Gewebe von älteren oder reiferen Tieren gut, um gesünderes Gewebe bereitzustellen.

Sah

Das Sägemikrotom ist speziell für harte Materialien wie Zähne oder Knochen geeignet. Das Mikrotom dieses Typs hat eine versenkte rotierende Säge, die die Probe durchschneidet. Die minimale Schnittdicke beträgt ca. 30 µm und ist für vergleichsweise große Proben herstellbar.

Laser

Ein konzeptionelles Diagramm des Lasermikrotombetriebs

Das Lasermikrotom ist ein Instrument zum berührungslosen Schneiden. Eine vorherige Vorbereitung der Probe durch Einbetten, Einfrieren oder chemische Fixierung ist nicht erforderlich, wodurch die Artefakte von Präparationsmethoden minimiert werden. Alternativ kann dieses Mikrotom-Design auch für sehr harte Materialien wie Knochen oder Zähne sowie einige Keramiken verwendet werden. Abhängig von den Eigenschaften des Probenmaterials liegt die erreichbare Dicke zwischen 10 und 100 µm.

Das Gerät arbeitet mit einer Schneidwirkung eines Infrarotlasers. Da der Laser eine Strahlung im nahen Infrarot emittiert, kann der Laser in diesem Wellenlängenbereich mit biologischen Materialien wechselwirken. Durch scharfe Fokussierung der Sonde innerhalb der Probe kann ein Brennpunkt sehr hoher Intensität, bis zu TW /cm 2 , erreicht werden. Durch die nichtlineare Wechselwirkung der optischen Durchdringung im Fokusbereich wird eine Materialtrennung in einem als Photodisruption bekannten Prozess eingeleitet. Durch die Begrenzung der Laserpulsdauern auf den Femtosekundenbereich wird der Energieaufwand im Zielbereich präzise gesteuert und damit die Wechselwirkungszone des Schnitts auf unter einen Mikrometer begrenzt. Außerhalb dieser Zone führt die ultrakurze Strahlanwendungszeit zu einer minimalen bis keinen thermischen Beschädigung des Rests der Probe.

Die Laserstrahlung wird auf ein optisches System auf Basis eines schnellen Abtastspiegels gerichtet, das eine dreidimensionale Positionierung des Strahlübergangs ermöglicht, während der Strahl zum gewünschten interessierenden Bereich durchquert werden kann. Die Kombination aus hoher Leistung mit hoher Rasterrate ermöglicht es dem Scanner, große Probenbereiche in kurzer Zeit zu schneiden. Im Lasermikrotom ist auch die Laser-Mikrodissektion von inneren Bereichen in Geweben, Zellstrukturen und anderen Arten von kleinen Merkmalen möglich.

Messer

Eine Diamantmesserklinge zum Schneiden von ultradünnen Schnitten (typischerweise 70 bis 350 nm) für die Transmissionselektronenmikroskopie.
Die Schneide einer Einwegklinge für ein Mikrotom unter dem Mikroskop.

Die Auswahl des Mikrotommesser-Klingenprofils hängt vom Material und der Vorbereitung der Proben sowie den endgültigen Probenanforderungen (zB Schnittdicke und -qualität) ab.

Design- und Schnittarten

Profile von Mikrotommessern.

Im Allgemeinen zeichnen sich Messer durch das Profil der Messerklinge aus, das in die Kategorien der ebenen konkaven, keilförmigen oder meißelförmigen Designs fällt.

Planar konkave Mikrotommesser sind extrem scharf, aber auch sehr empfindlich und werden daher nur bei sehr weichen Proben verwendet. Die Keilprofilmesser sind etwas stabiler und finden Verwendung in mäßig harten Materialien, wie zum Beispiel beim Epoxid- oder kryogenen Probenschneiden. Schließlich erhöht das Meißelprofil mit seiner stumpfen Schneide die Stabilität des Messers, erfordert aber deutlich mehr Kraft, um den Schnitt zu erzielen.

Für Ultramikrotome werden Glas- und Diamantmesser benötigt, die Schnittbreite der Klinge liegt daher in der Größenordnung von wenigen Millimetern und ist damit deutlich kleiner als bei klassischen Mikrotommessern. Glasmesser werden normalerweise durch das Brechen von Glasstäben unter Verwendung spezieller "Messer-Maker"-Brechvorrichtungen hergestellt. Glasmesser können für die erste Probenvorbereitung verwendet werden, auch wenn Diamantmesser zum endgültigen Trennen verwendet werden. Glasmesser haben normalerweise kleine Tröge aus Plastikband, die mit Wasser gefüllt sind, damit die Probe für die spätere Entnahme schwimmen kann. Diamanttrennscheiben können in eine solche vorhandene Rinne eingebaut werden, wodurch die gleiche Sammelmethode ermöglicht wird.

Schneiden

Vor dem Schneiden mit dem Mikrotom werden biologische Materialien normalerweise in einem steiferen Fixiermittel in einem als Einbettung bezeichneten Prozess platziert. Dies wird durch das Einströmen einer flüssigen Substanz um die Probe, wie Paraffin (Wachs) oder Epoxid, erreicht, die in eine Form gegeben und später zu einem "Block" gehärtet wird, der leicht geschnitten werden kann.

Die Deklination ist der Kontaktwinkel zwischen Probenvertikale und Messerklinge. Bei rechtwinkliger Messerklinge (Deklination = 90) erfolgt der Schnitt direkt im druckbasierten Modus, die Kräfte sind daher proportional größer. Wenn das Messer jedoch gekippt wird, verläuft die Relativbewegung des Messers zunehmend parallel zur Probenbewegung, was einen Schneidevorgang ermöglicht. Dieses Verhalten ist bei großen oder harten Proben sehr wichtig

Die Neigung des Messers ist der Winkel zwischen der Messerfläche und der Probe. Für ein optimales Ergebnis muss dieser Winkel entsprechend gewählt werden. Der optimale Winkel hängt von der Messergeometrie, der Schnittgeschwindigkeit und vielen anderen Parametern ab. Wenn der Winkel auf Null eingestellt wird, kann der Messerschnitt oft unregelmäßig werden, und eine neue Position des Messers muss verwendet werden, um dies zu glätten.

Wenn der Winkel zu groß ist, kann die Probe zerknittern und das Messer kann periodische Dickenschwankungen im Schnitt verursachen. Durch weiteres Vergrößern des Winkels, so dass er zu groß wird, kann die Messerklinge selbst beschädigt werden.

Siehe auch

Verweise

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Externe Links