Mausmodelle von Brustkrebsmetastasen - Mouse models of breast cancer metastasis

Metastasierendem Brustkrebs Mausmodelle sind experimentelle Ansätze , bei denen die Mäuse genetisch manipulierten zur Entwicklung eines Mamma - Tumor zu weit entfernten fokale Läsionen der Brust führenden Epithel erstellt von Metastasen . Brustkrebs bei Mäusen kann durch genetische Mutationen verursacht werden , die beim menschlichen Krebs identifiziert wurden. Dies bedeutet, dass Modelle basierend auf molekularen Läsionen generiert werden können, die mit der menschlichen Krankheit übereinstimmen.

Metastasen bei Brustkrebs

Metastasierung ist ein Prozess der Migration von Tumorzellen von der primären Krebsstelle zu einem entfernten Ort, wo die Krebszellen sekundäre Tumoren bilden. Metastasierender Brustkrebs stellt die verheerendste Eigenschaft von Krebs dar und gilt als ein Ereignis im fortgeschrittenen Stadium. Menschlicher Brustkrebs metastasiert in mehrere entfernte Organe wie Gehirn , Lunge , Knochen und Leber .

Genetische Diversität zwischen primärem und metastasiertem Tumor

Die in den frühen 70er Jahren entwickelte klassische Theorie ging davon aus, dass Metastasen auf genetisch bedingte Subpopulationen in Primärtumoren zurückzuführen sind. Die genetische Varianz zwischen metastatischen Herden ist nur für einen bestimmten Locus und innerhalb bestimmter Zellpopulationen signifikant oder nur eine Zellpopulation zeigt Unterschiede und einige Loci weichen nur in einer Zellsubpopulation ab. Dies erklärt das Konzept der Tumorheterogenität und die Reihenfolge genetischer Ereignisse während der Tumorentwicklung . Viele der Gene, die das Wachstum an der primären Stelle antreiben, können die Verbreitung und Besiedelung an der ektopischen Stelle bestimmen . Brustkrebs wird genetisch und klinisch einvernehmlich als heterogene Erkrankung betrachtet, da er die Heterogenität des normalen Brustgewebes an seinem Ursprung widerspiegelt17873350. Um einzelne Tumorzellen zu ermöglichen, die an einer ektopen Stelle wachsen können, müssen eine Reihe von diskreten genetischen Ereignissen eintreten. Die Metastasenprogression hängt von der Regulierung von Entwicklungsprogrammen und Umweltereignissen ab. Das metastatische Potenzial von Subpopulationen innerhalb von Mausbrustzellen wird heute als relativ frühes Ereignis angesehen, und die Verbreitung erfolgt gleichzeitig mit präinvasiven oder mikroinvasiven Läsionen. Die genetischen Profile von primären und metastatischen Läsionen in Brustkarzinomen zeigen , weitgehend von klonalen pertinence zwischen Läsionen. Es gibt verschiedene Prävalenzmuster für genetische Mutationen in den Genomen des primären Brusttumors und seiner Metastasen. Es bestätigt auch die genetische Heterogenität zwischen dem primären Neoplasma von Brustkrebspatientinnen und ihren jeweiligen Metastasen.

Gene, die an der organspezifischen Metastasierung beteiligt sind

Brustkrebs- Phänotypen exprimieren periodisch Gene in Metastasen, die für den Metastasierungsprozess unverzichtbar sind. Die metastatische Diversität wird durch die Aktivierung von Genen vermittelt, die als Kopplung an organspezifisches Wachstum dienen. Das Wachstum von Läsionen an der ektopischen Stelle hängt von mehreren komplexen Interaktionen zwischen metastatischen Zellen und homöostatischen Mechanismen des Wirts ab . Letale Protein-Protein-Wechselwirkungen an der metastatischen Stelle unterstützen das Überleben adaptierter Zellen.

Generierung von Mausmodellen von Brustkrebs

Die gezielte Expression von Onkogenen in Brustepithelzellen von Mäusen ist eine Möglichkeit, Brustkrebs beim Menschen zu modellieren. Mutation oder Überexpression von Onkogenen kann eher in einem sehr spezifischen zellulären Kontext als im gesamten Organismus unter kontrollierter Expression gehalten werden. Eine andere Möglichkeit, Brustkrebs beim Menschen zu modellieren, ist die gezielte Hemmung eines Tumorsuppressorgens.

Mäuse in der Genforschung

Mensch und Maus: ein genomischer Vergleich

Genetische Studien zu Volkskrankheiten beim Menschen unterliegen aus praktischen und ethischen Gründen erheblichen Einschränkungen . Menschliche Zelllinien können verwendet werden, um Krankheiten zu modellieren, aber es ist schwierig, Prozesse auf Gewebeebene , innerhalb eines Organs oder im gesamten Körper zu untersuchen. Mäuse können eine gute Darstellung von Krankheiten beim Menschen sein, weil:.

  • Es gibt enge Ähnlichkeiten in Physiologie , Entwicklung und Zellbiologie zwischen Mäusen und Menschen.
  • Sowohl Mensch als auch Maus besitzen etwa 30.000 proteinkodierende Gene. Die Zahl der Mausgene ohne entsprechendes humanes Homolog beträgt weniger als 1%.
  • 90 % der Genome von Mensch und Maus sind syntenisch .
  • 40% der Genome von Mensch und Maus können auf Nukleotidebene ausgerichtet werden.
  • Mäuse haben relativ kurze Tragezeiten .
  • Mäuse brauchen eine kurze Zeit, um die Geschlechtsreife zu erreichen.
  • Mäuse haben große Wurfgrößen.
  • Die Verfügbarkeit von Hunderten von Mutationen, die fast jedes Gewebe und jeden Aspekt der Entwicklung betreffen.

Mäuse sind möglicherweise kein ideales Modell für Brustkrebs. Dies liegt vor allem an der mangelnden Präzision vieler Modelle. Bei der Betrachtung von Metastasen ist es schwierig, den genauen Ort sowie die Häufigkeit zu bestimmen. Ein weiteres Problem dreht sich um die epithelialen Subtypen und die Unfähigkeit, sie beim Zielen einer Mutation gezielt anzugreifen. Ein Beispiel hierfür wäre die Bestimmung der Tumorentwicklung bei K14-Cre BRCA2-Mäusen. In einem Standardfall führte die Exzision von BRCA2 zu keiner Tumorgenese, aber wenn p53 mutiert und inaktiviert wäre, würde eine Tumorgenese auftreten. Daher gibt es aufgrund der zusätzlichen Mutation in p53 keine definitive Antwort in Bezug auf den Ursprung des Tumors.

Metastasierende Maus-Mammakarzinom-Zelllinien

Verschiedene Mammakarzinom-Zelllinien von Mäusen , wie 4T1 und TS/A , sind in syngenen immunkompetenten Mäusen metastatisch und können verwendet werden, um Gene und Signalwege zu identifizieren, die am Metastasierungsprozess beteiligt sind.

Einfache Tumortransplantationsmodelle

Die Transplantation von Tumorzellen in immundefiziente Mäuse ist ein Werkzeug, um Brustkrebs und seine metastatischen Wirkungen zu untersuchen. Die Transplantation erfolgt entweder als Allotransplantat oder als xenographische Transplantation. Gewöhnlich werden menschliche Zellen in einen immungeschwächten murinen Empfänger geimpft . Beimpfen von Zellen durch intraduktale Transplantationen, durch Injektionen von gereinigtem Brustfettpolster oder durch Transplantationen in die Schwanzvene. Je nach Injektionsweg können verschiedene Organe mit Brustkrebszellen besät werden

  • Herzinjektion: Knochen
  • Schwanzveneninjektion: Lunge
  • Milzinjektion: Leber
  • Halsschlagader Injektion: Gehirn

Modelle zur Tumorgewebetransplantation

Die verwendeten spezifischen immundefizienten Mäuse waren NOD/SCID-Mäuse (nicht fettleibiger Diabetiker/schwerer konditionaler Immundefekt). Diese Mutationen ermöglichen die Integration von neuem Xenotransplantat-Gewebe. Die Brustfettpolster der Maus müssen zuerst humanisiert werden, indem humane Telemorase-immortalisierte humane Bruststromafibroblasten (RMF/EG-Fibroblasten) in die Brustfettpolster injiziert werden. Ohne diese Injektion können sich die auf das Kissen eingepflanzten menschlichen Brustepithelzellen nicht ansiedeln und wachsen. Der RMF/EG-Fibroblast muss dann bestrahlt werden, um die Expression von Schlüsselproteinen und Wachstumsfaktoren zu ermöglichen. Nach 4 Wochen Entwicklung expandierten die neu transplantierten menschlichen Brustepithelzellen innerhalb des Fettpolsters.

Gentechnisch veränderte Mäuse zur Untersuchung von Metastasen

Gentechnisch veränderte Mäuse werden konstruiert, um menschliche Phänotypen und Pathologien zu modellieren . Mutante Mäuse können Transgene unter Verwendung verschiedener Verabreichungsmethoden enthalten:

Transgene Mausmodelle von Brustkrebs

Die Mäuse, die den Prozess der Transgenese durchlaufen, werden als transgene Mäuse bezeichnet. Ein basisches Transgen hat eine Promotorregion , eine Proteincodierungssequenz, ein Intron und ein Stopcodon . Maus-Mamma-Tumor-Virus (MMTV) ist ein Retrovirus, von dem bekannt ist, dass es nach Aktivierung Brusttumore verursacht. MMTV ist ein erbliches somatisches Mutagen, dessen Zielbereich begrenzt ist. Es enthält eine regulatorische DNA-Sequenz, die als Long Terminal Repeat (LTR) bezeichnet wird und die durch Steroidhormone induzierbare Transkription fördert. Eine Tumorgenese, die durch das Maus-Mammatumorvirus induziert wurde, kann auch durch Integration des viralen Genoms erfolgen. Es ist bekannt, dass die Integrationsstellen kritische Gene für die zelluläre Regulation sind. Molkensäureprotein (WAP) ist ein weiterer häufiger Promotor, der verwendet wird, um Maus-Brustkrebsmodelle zu generieren. Für eine Liste anderer Brustdrüsen-spezifischer Promotoren und Mausmodelle siehe.

Schematische Darstellung von Brustkrebsmetastasen-Studienmodellen

MMTV-PyMT

MMTV-PyMT ist das Modell der Brustkrebsmetastasierung, bei dem MMTV-LTR verwendet wird, um die Expression des Brustdrüsen-spezifischen Polyomavirus mittleren T-Antigens voranzutreiben , was zu einer schnellen Entwicklung von stark metastasierenden Tumoren führt. MMTV-PyMT ist das am häufigsten verwendete Modell zur Untersuchung der Progression und Metastasierung von Brusttumoren. MMTV-PyMT-Mäuse werden dann mit anderen genetisch veränderten Mäusen gekreuzt, um verschiedene Arten von Brustkrebsmodellen zu generieren, darunter:

MMTV- HER2/neu

Der MMTV-LTR kann auch verwendet werden, um die Rezeptor-Tyrosin-Proteinkinase ErbB2 zu fördern, um das Brustepithel der Maus zu transformieren. ErbB2 ist ein Onkogen, das bei etwa 20 % der menschlichen Brustkrebserkrankungen amplifiziert und überexprimiert wird. Die Mäuse, die dieses Onkogen beherbergen, entwickeln etwa 15 Wochen nach der Trächtigkeit multifokale Adenokarzinome mit Lungenmetastasen. Um eine genauere Darstellung der HER2-Genmutationen zu erstellen, haben die Forscher das neu enthaltende Mausgen und ein neu enthaltendes Rattengen fusioniert. Dies adressiert das Problem in Bezug auf die Modellierung der Amplifikation von HER2 in der Mäuseentwicklung. Bei der nicht verschmolzenen Maus würde die Brustdrüse zu einer nahezu jungfräulichen Frau werden, aber mit dieser Hinzufügung behielt die Brustdrüse die entwickelte Funktion bei.

Bi-transgene Modelle

Mausmodelle mit zwei Transgenen werden als bi-transgen bezeichnet. Um das Zusammenwirken von zwei Onkogene zu überprüfen, Tim Stewert und Gruppe 1987 , die ersten bi-transgenen Mausmodelle gemacht, MMTV- Myc und MMTV- Ras - Mäuse wurden mit einer resultierenden Beschleunigung in Tumorigenese gekreuzt. Expression von TGFβ in den Brustkrebszellen von MMTV-ErbB2; MMTV-TGFβ-doppelt-transgene Mäuse können höhere Spiegel an zirkulierenden Tumorzellen und Lungenmetastasen induzieren. Das Ras-Gen kann mit rtTA (reverse tetracyclin transactivator) kombiniert werden , um ein bi-transgenes induzierbares Mausmodell durch Tetracyclin-kontrollierte transkriptionale Aktivierung zu generieren, z Tetracyclin-Transaktivator (rtTA) in Brustepithelzellen.

Tri-transgene Modelle

Tri-transgene Mausmodelle bestehen aus mehr als zwei Genen. Mehrfachkombinationen und genetische Modifikationen werden so vorgenommen, dass entweder eines oder alle Gene in einen kontinuierlich exprimierten Zustand versetzt oder kontrolliert zu unterschiedlichen Zeitpunkten aktiviert werden. Zum Beispiel TOM(TetO-myc); TOR; MTB-Mäuse, bei denen sowohl das myc (M)- als auch das ras (R)-Gen unter der Kontrolle von Tetracyclin-Operatoren stehen. Sie können auch beide durch Zugabe von Doxycyclin aktiviert oder deaktiviert werden. Andere Kombinationen in dieser Hinsicht sind TOM; Kras; MTB, wobei myc zu verschiedenen Zeitpunkten induziert und nicht induziert werden kann, während Kras in einem kontinuierlichen exprimierten Zustand ist, und myc; TOR; MTB-Modell ist umgekehrt.

Anwendungen genetisch veränderter Mäuse zur Untersuchung von Metastasen

Die Metastasenkaskade kann untersucht werden, indem die Genaktivierung unter Kontrolle gehalten wird oder indem ein Reportergen hinzugefügt wird, zB Beta-Aktin GFP (Grün fluoreszierendes Protein) oder RFP (Rot fluoreszierendes Protein).

Identifizierung von Genen, die die Metastasierung regulieren

Durch Knock-in/Knock-out spezifischer Gene durch homologe Rekombination kann das Ausmaß der Metastasierung gemessen und neue Zielgene identifiziert werden, zB ein Gen, das das metastatische Verhalten von Krebszellen konsequent reguliert, ist TGF-β1. Eine akute Ablation des TGF-β-Signalwegs in MMTV-PyMT-Mammatumorzellen führt zu einer fünffachen Zunahme der Lungenmetastasen. Bestimmte Enhancer-Regionen können auch analysiert und als ein entscheidender Teil der Zellproliferation bestimmt werden, zB eine Enhancer-Region, die mit einem krebskritischen Gen p53 assoziiert ist, das über CRISPR-Cas9 bestimmt wurde.

Lineage Tracing in Metastasenmodellen

Die quantitativen Lineage-Tracing-Strategien haben sich als erfolgreich erwiesen, um Zellschicksale in normalen Epithelgeweben entweder unter Verwendung von gewebespezifischen oder stammzellspezifischen Transgenen aufzuklären. Um ein induzierbares Lineage-Tracing-Experiment durchzuführen, müssen zwei Komponenten in das Mausgenom eingebaut werden: ein Schalter und ein Reporter. Der Schalter ist üblicherweise eine arzneimittelregulierte Form des bakteriellen Enzyms Cre-Rekombinase. Dieses Enzym erkennt spezifische Sequenzen, sogenannte LoxP-Sites. Proteine, die in der Lage sind, die Identifizierung von markierten Zellen oder einer spezifischen Population in unmarkierten Zellen zu verbessern, werden von den Reportertransgenen kodiert. Nach dem Ernten aller zehn Mausbrustdrüsen von den transgenen Mäusen wird gewöhnlich eine Einzelzellsuspension hergestellt und entweder in die Schwanzvene von nicht transgenen Empfängermäusen oder in das gereinigte Fettpolster von nicht transgenen Mäusen transplantiert, wobei das Brustfettpolster wieder besiedelt wird. Diese Zellen werden dann im Blutstrom, in der Lunge, im Knochenmark und in der Leber verfolgt, um nach dem günstigen Ort der Metastasierung zu suchen. Diese transgenen Zellen können anhand ihrer besonderen Merkmale der Fluoreszenz verfolgt oder durch Platzierung der Empfänger auf Doxycyclin-Nahrung induziert werden.

Zirkulierende Tumorzellen

Ein weiteres Instrument zur Untersuchung von Brustkrebsmetastasen ist die Suche nach zirkulierenden Tumorzellen in transgenen Mäusen, zB können MMTV-PyMT-Mäuse auf verschiedene Therapien ansprechen, indem sie Tumorzellen aus dem Blut ausscheiden, die zu Lungenmetastasen führen. Nicht nur im Blut, sondern auch im Knochenmark können Zellen nachgewiesen werden, zB wurden Zytokeratin- positive Zellen im Knochenmark von MMTV-pyMT- und MMTV-Neu-transgenen Mäusen identifiziert, jedoch nicht in den Wildtyp-Kontrollen.

Einschränkungen

In Abwesenheit spezifischer Marker für Brustzellen bieten Modelle mit genetischer Markierung von Tumorzellen den besten experimentellen Vorteil, jedoch schränkt das geringe Volumen an peripherem Blut, das von lebenden Tieren gewonnen werden kann, die Anwendung dieser Technik ein.

In-vivo- Bildgebung von metastasierten Mausmodellen

Transgene Mausmodelle können durch verschiedene nicht-invasive Techniken abgebildet werden.

Biolumineszenz-Bildgebung

Biolumineszenz-Bildgebung

Die Biolumineszenz-Bildgebung beruht auf der Detektion von Licht, das durch die enzymatische Oxidation eines exogenen Substrats erzeugt wird. Das Substrat Luciferin wird in Gegenwart von Luciferase zu Oxyluciferin oxidiert und emittiert Licht, das mit einem IVIS-System wie einer Xenogen-Maschine nachgewiesen werden kann. Dissoziierte Brustzellen von MMTV-PyMT: IRES: Luc; MTB ( Interne Ribosomen-Eintrittsstelle : Luciferin )-Tiere (die nicht Doxycyclin ausgesetzt waren) können in die seitlichen Schwanzvenen von immundefizienten Mäusen mit einer Doxycyclin-freien Diät injiziert werden. In den Lungen von Empfängermäusen wird kein Biolumineszenzsignal beobachtet, bis ihnen Doxycyclinfutter verabreicht wird. Biolumineszenz kann dann innerhalb von 2 Wochen nach Beginn der Doxycyclin-Exposition in der Brust nachgewiesen werden. Luciferase wird kurz vor der Aufnahme der Bilder injiziert.

Fluoreszierende Bildgebung

Die Intravitalmikroskopie mit Multiphotonenanregung ist eine Technik, um gentechnisch veränderte Zellen direkt in vivo sichtbar zu machen. Mehrstufige metastatische Kaskaden können durch Markierung mit einer einzigartigen Fluoreszenzfarbe unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden .

Radioisotope Bildgebung

Positronen-Emissions-Tomographie (PET), Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (SPECT) und Computertomographie (CT) wurden verwendet, um die Effizienz dieser In-vivo-Bildgebung zur Früherkennung von Läsionen zu vergleichen und das Ansprechen auf eine Chemotherapie zu bewerten.

MRT-Bildgebung

Die Magnetresonanztomographie erfordert die Verwendung von Nanopartikeln (Liposomen) und einem MRT-Kontrastmittel namens Gadolinium. Die Partikel wurden dann über einen Polycarbonat-Membranfilter in Vesikel eingebracht. Die Nanopartikel werden in die Mäuse mit Metastasen injiziert und dort für 24 Stunden belassen. Diese Mäuse werden dann gescannt, und in der Bildgebungssoftware gibt es Ansammlungen dieser Partikel in bestimmten Bereichen, in denen Zellen metastasiert haben.

Siehe auch

Verweise

Externe Links