Streptavidin - Streptavidin

Streptavidin
Streptavidin.png
Monomeres Streptavidin (Banddiagramm) mit gebundenem Biotin (Kugeln); PDB : 1STP​
Bezeichner
Organismus Streptomyces avidinii
Symbol ?
UniProt P22629

Streptavidin / ˌ s t r ɛ p t æ v ɪ d ɪ n / ist ein 66,0 (Tetramer) kDa - Protein aus dem gereinigten Bakterium Streptomyces avidinii . Streptavidin -Homotetramere haben eine außerordentlich hohe Affinität zu Biotin (auch bekannt als Vitamin B7 oder Vitamin H). Mit einer Dissoziationskonstante (K d ) in der Größenordnung von ≈10 −14 mol/L ist die Bindung von Biotin an Streptavidin eine der stärksten nichtkovalenten Wechselwirkungen, die in der Natur bekannt sind. Streptavidin wird aufgrund der Beständigkeit des Streptavidin-Biotin-Komplexes gegenüber organischen Lösungsmitteln, Denaturierungsmitteln (zB Guanidiniumchlorid ), Detergenzien (zB SDS , Triton X-100 ), proteolytischen Enzymen und extremen Temperaturen und pH-Werten in großem Umfang in der Molekularbiologie und Bionanotechnologie verwendet .

Struktur

Tetramere Struktur von Streptavidin mit 2 gebundenen Biotinen

Die Kristallstruktur von Streptavidin mit gebundenem Biotin wurde 1989 von zwei Gruppen beschrieben. Die Struktur wurde von Hendrickson et al. an der Columbia University und unter Verwendung mehrfacher isomorpher Ersetzung von Weber et al. in der zentralen Forschungs- und Entwicklungsabteilung von EI DuPont. Mit Stand September 2017 sind 171 Strukturen in der Proteindatenbank hinterlegt . Eine vollständige Liste finden Sie unter diesem Link . Die N- und C-Termini des Proteins voller Länge mit 159 Resten werden prozessiert, um ein kürzeres „Kern“-Streptavidin zu ergeben, das normalerweise aus den Resten 13–139 besteht; Die Entfernung der N- und C-Termini ist für die höchste Biotin-Bindungsaffinität erforderlich. Die Sekundärstruktur eines Streptavidin-Monomers besteht aus acht antiparallelen β-Strängen, die sich falten, um eine antiparallele β-Barrel- Tertiärstruktur zu ergeben. An einem Ende jedes β-Fass befindet sich eine Biotin- Bindungsstelle. Vier identische Streptavidin-Monomere (dh vier identische β-Fässer) assoziieren, um die tetramere Quartärstruktur von Streptavidin zu ergeben. Die Biotin-Bindungsstelle in jedem Fass besteht aus Rückständen aus dem Inneren des Fasses, zusammen mit einem konservierten Trp120 aus einer benachbarten Untereinheit. Auf diese Weise trägt jede Untereinheit zur Bindungsstelle der benachbarten Untereinheit bei, so dass das Tetramer auch als Dimer funktioneller Dimere angesehen werden kann.

Ursprünge der hohen Affinität

Die zahlreichen Kristallstrukturen des Streptavidin-Biotin-Komplexes geben Aufschluss über den Ursprung der bemerkenswerten Affinität. Erstens besteht eine hohe Formkomplementarität zwischen der Bindungstasche und Biotin. Zweitens wird ein ausgedehntes Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen zu Biotin gebildet, wenn es sich an der Bindungsstelle befindet. Es gibt acht Wasserstoffbrückenbindungen, die direkt zu Resten in der Bindungsstelle (der sogenannten 'ersten Schale' der Wasserstoffbrückenbindung) hergestellt werden, an denen die Reste Asn23, Tyr43, Ser27, Ser45, Asn49, Ser88, Thr90 und Asp128 beteiligt sind. Es gibt auch eine „zweite Schale“ von Wasserstoffbrückenbindungen, die Reste umfasst, die mit den Resten der ersten Schale wechselwirken. Die Streptavidin-Biotin-Affinität übersteigt jedoch diejenige, die allein aus den Wasserstoffbrücken-Wechselwirkungen vorhergesagt werden würde, was auf einen anderen Mechanismus hindeutet, der zu der hohen Affinität beiträgt. Die Biotin-bindende Tasche ist hydrophob , und es gibt zahlreiche Van-der-Waals-Kraft- vermittelte Kontakte und hydrophobe Wechselwirkungen mit dem Biotin, wenn es sich in der Tasche befindet, was ebenfalls für die hohe Affinität verantwortlich ist. Insbesondere ist die Tasche mit konservierten Tryptophanresten ausgekleidet. Schließlich wird die Biotinbindung von der Stabilisierung einer flexiblen Schleife begleitet, die die β-Stränge 3 und 4 (L3/4) verbindet, die sich über dem gebundenen Biotin schließt, wie ein „Deckel“ über der Bindungstasche wirkt und zum extrem langsamen Biotin beiträgt Dissoziationsrate.

Die meisten Versuche, Streptavidin zu mutieren, führen zu einer verringerten Biotin-Bindungsaffinität, die in einem so hoch optimierten System zu erwarten ist. Bei einer kürzlich manipulierten Streptavidin-Mutante namens Traptavidin wurde jedoch festgestellt, dass sie zusätzlich zu einer höheren thermischen und mechanischen Stabilität eine mehr als zehnmal langsamere Biotindissoziation aufweist. Diese verringerte Dissoziationsrate wurde von einer zweifachen Abnahme der Assoziationsrate begleitet.

Die Biotin-Bindungsaffinität kann durch chemische Markierung von Streptavidin, wie mit Amin-reaktiven Fluorophoren , beeinträchtigt werden ; Flavidin ist eine Streptavidin-Mutante ohne Lysin-Seitenketten, die nach einer solchen Fluoreszenzfarbstoffmarkierung, bei der der Farbstoff an den Aminoterminus koppelt, gute Biotin-Bindungseigenschaften beibehält.

Anwendungen in der Biotechnologie

Zu den häufigsten Anwendungen von Streptavidin gehören die Reinigung oder der Nachweis verschiedener Biomoleküle. Die starke Streptavidin-Biotin-Wechselwirkung kann verwendet werden, um verschiedene Biomoleküle aneinander oder an einen festen Träger zu binden. Harte Bedingungen sind erforderlich, um die Streptavidin-Biotin-Wechselwirkung zu unterbrechen, die häufig das zu reinigende interessierende Protein denaturiert. Es wurde jedoch gezeigt, dass eine kurze Inkubation in Wasser über 70 °C die Wechselwirkung (zumindest für biotinylierte DNA) reversibel bricht, ohne Streptavidin zu denaturieren, was eine Wiederverwendung des festen Streptavidin-Trägers ermöglicht. Eine weitere Anwendung von Streptavidin ist die Reinigung und der Nachweis von Proteinen, die mit dem Strep-Tag- Peptid genetisch modifiziert wurden . Streptavidin wird häufig in Western Blotting und Immunoassays verwendet, die an einige Reportermoleküle wie Meerrettichperoxidase konjugiert sind . Streptavidin wurde auch auf dem sich entwickelnden Gebiet der Nanobiotechnologie verwendet , der Verwendung biologischer Moleküle wie Proteine ​​oder Lipide, um nanoskalige Vorrichtungen/Strukturen zu schaffen . In diesem Zusammenhang kann Streptavidin als Baustein verwendet werden, um biotinylierte DNA-Moleküle zu verbinden, um einwandige Kohlenstoff-Nanoröhrchen- Gerüste oder sogar komplexe DNA-Polyeder zu bilden. Das tetramere Streptavidin wurde auch als Drehscheibe verwendet, um die herum andere Proteine ​​angeordnet werden können, entweder durch ein Affinitäts-Tag wie Strep-Tag oder AviTag oder durch genetische Fusion mit SpyTag . Die Fusion mit SpyTag ermöglichte die Erzeugung von Baugruppen mit 8 oder 20 Streptavidin-Untereinheiten. Neben einer molekularen Kraftsonde für Rasterkraftmikroskopiestudien wurden auch neuartige Materialien wie 3D-Kristallgitter geschaffen. Streptavidin hat einen schwach sauren isoelektrischen Punkt (pI) von ~5, aber auch eine rekombinante Form von Streptavidin mit einem nahezu neutralen pI ist im Handel erhältlich.

Gezielte Immuntherapie

Bei der prätargetierten Immuntherapie wird Streptavidin verwendet, das an einen monoklonalen Antikörper gegen krebszellspezifische Antigene konjugiert ist, gefolgt von einer Injektion von radioaktiv markiertem Biotin, um die Strahlung nur an die Krebszelle abzugeben. Anfängliche Hürden sind die Sättigung der Biotin-Bindungsstellen auf Streptavidin mit endogenem Biotin anstelle des injizierten radioaktiv markierten Biotins und eine hohe radioaktive Belastung der Nieren aufgrund der starken Zelladsorptionseigenschaften von Streptavidin. Derzeit wird angenommen, dass dieses hohe Bindungsniveau an adhärente Zelltypen, wie aktivierte Blutplättchen und Melanome, ein Ergebnis der Integrinbindung ist, die durch die RYD-Sequenz in Streptavidin vermittelt wird.

Varianten mit kontrollierter Anzahl von Bindungsstellen

Monovalent vs. monomer
Schematischer Vergleich von monovalentem und monomerem Streptavidin

Streptavidin ist ein Tetramer und jede Untereinheit bindet Biotin mit gleicher Affinität. Multivalenz ist ein Vorteil bei Anwendungen wie der MHC-Tetramerfärbung , bei der Aviditätseffekte die Fähigkeit von an Streptavidin gebundenen MHC-Molekülen zum Nachweis spezifischer T-Zellen verbessern. In anderen Fällen, wie der Verwendung von Streptavidin zur Abbildung spezifischer Proteine ​​auf Zellen, kann Multivalenz die Funktion des interessierenden Proteins stören. Monovalentes Streptavidin ist eine gentechnisch hergestellte rekombinante Form von Streptavidin, das ein Tetramer ist, aber nur eine der vier Bindungsstellen ist funktionsfähig. Diese einzelne Bindungsstelle hat eine Affinität von 10 –14 mol/L und kann keine Quervernetzung verursachen. Zu den Anwendungen von monovalentem Streptavidin gehörten die Fluoreszenzverfolgung von Zelloberflächenrezeptoren , die Dekoration von DNA-Origami und die Funktion als Zeiger zur Identifizierung spezifischer Regionen für die Kryo-Elektronenmikroskopie .

Monomeres Streptavidin ist eine rekombinante Form von Streptavidin mit Mutationen, um das Tetramer in ein Monomer zu brechen und die Löslichkeit der resultierenden isolierten Untereinheit zu erhöhen. Monomere Streptavidin-Versionen haben eine Affinität für Biotin von 10 –7 mol/L 10 –8 mol/L und sind daher für Markierungsanwendungen nicht ideal, aber für die Reinigung nützlich, wo Reversibilität erwünscht ist.

Zweiwertig
Slice durch Protein zum Vergleich der Biotin-Orientierung in cis-divalentem und trans-divalentem Streptavidin

Ein Streptavidin mit genau zwei Biotin-Bindungsstellen pro Tetramer kann durch Mischen von Untereinheiten mit und ohne funktioneller Biotin-Bindungsstelle und Reinigung durch Ionenaustauschchromatographie hergestellt werden . Die funktionellen Bindungsstellen weisen dabei die gleiche Biotin-Bindungsstabilität wie Wildtyp-Streptavidin auf. Zweiwertiges Streptavidin mit den beiden Biotin-Bindungsstellen zusammen (cis-divalent) oder getrennt (trans-divalent) kann separat gereinigt werden.

Dreiwertig

Auch ein Streptavidin mit genau drei Biotin-Bindungsstellen pro Tetramer kann nach dem gleichen Prinzip wie bei divalenten Streptavidinen hergestellt werden.

Hochvalente Streptavidine

Streptavidine höherer Wertigkeit wurden durch Anwendung der Chemie der Isopeptidbindungskonjugation unter Verwendung der SpyTag/SpyCatcher- Technologie erhalten. Dies beinhaltet ein Streptavidin-Tetramer mit drei Biotin-Bindungsstellen und ein totes Streptavidin, das entweder mit SpyTag oder SpyCatcher fusioniert ist. Wenn die verschiedenen Tetramere miteinander vermischt werden, tritt eine kovalente Bindung auf, um eine höhere Anzahl von Biotin-Bindungsstellen zu ermöglichen. Mit diesem Verfahren wurden sechs und zwölf Biotin-Bindungsstellen pro Molekül hergestellt.

Vergleich zu Avidin

Streptavidin ist nicht das einzige Protein, das mit hoher Affinität an Biotin binden kann. Avidin ist das andere bemerkenswerteste Biotin-bindende Protein. Ursprünglich aus Eigelb isoliert, weist Avidin nur 30% Sequenzidentität mit Streptavidin auf, aber eine fast identische Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur. Avidin hat eine höhere Affinität für Biotin (Kd ~ 10 −15 M), aber im Gegensatz zu Streptavidin ist Avidin glykosyliert, positiv geladen, hat pseudokatalytische Aktivität (Avidin kann die alkalische Hydrolyse einer Esterbindung zwischen Biotin und einer Nitrophenylgruppe verstärken ) und hat eine höhere Aggregationsneigung. Andererseits ist Streptavidin der bessere Biotin-Konjugat-Binder; Avidin hat eine geringere Bindungsaffinität als Streptavidin, wenn Biotin an ein anderes Molekül konjugiert wird, obwohl Avidin die höhere Affinität für freies, unkonjugiertes Biotin hat. Da Streptavidin keine Kohlenhydratmodifikation aufweist und einen nahezu neutralen pI aufweist , hat es den Vorteil einer viel geringeren unspezifischen Bindung als Avidin. Deglykosyliertes Avidin (NeutrAvidin) ist eher vergleichbar mit der Größe, dem pI und der unspezifischen Bindung von Streptavidin.

Siehe auch

Verweise

Weiterlesen

Externe Links

Gruppen, die Streptavidin oder Proteine ​​der Avidin-Familie untersuchen und entwickeln (alphabetische Reihenfolge)