Cyanidioschyzon -Cyanidioschyzon
| Cyanidioschyzon | |
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Wissenschaftliche Klassifikation 
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| (ohne Rang): | Archaeplastida |
| Aufteilung: | Rhodophyta |
| Klasse: | Cyanidiophyceen |
| Befehl: | Cyanidiales |
| Familie: | Cyanidgewächse |
| Gattung: | Cyanidioschyzon |
| Spezies: |
C. merolae
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| Binomialer Name | |
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Cyanidioschyzon merolae P. De Luca, R. Taddei & L. Varano, 1978
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Cyanidioschyzon merolae ist eine kleine (2μm), keulenförmige, einzellige haploide Rotalge, die an schwefelsaure heißeQuellen(pH 1,5, 45 °C) angepasst ist. Die zelluläre Architektur von C. merolae ist extrem einfach, sie enthält nur einen einzelnen Chloroplasten und ein einzelnes Mitochondrium und es fehlt eine Vakuole und Zellwand . Außerdem können die Zell- und Organellenteilungen synchronisiert werden. Aus diesen Gründen gilt C. merolae als hervorragendes Modellsystem zur Untersuchung von Zell- und Organellenteilungsprozessen sowie der Biochemie und Strukturbiologie . Das Genom desOrganismuswar das erste vollständige Algengenom, das2004 sequenziert wurde; sein Plastid wurde 2000 und 2003 sequenziert und sein Mitochondrium 1998. Der Organismus gilt aufgrund seiner minimalistischen Zellorganisation als die einfachste eukaryotische Zelle.
Isolation und Wachstum in der Kultur
Ursprünglich von De Luca im Jahr 1978 aus den Solfatan- Fumarolen von Campi Flegrei ( Neapel, Italien ) isoliert, kann C. merolae in Kultur im Labor in modifiziertem Allen-Medium (MA) oder einer modifizierten Form mit der doppelten Konzentration einiger Elemente, genannt MA2. Bei Verwendung von MA-Medium sind die Wachstumsraten mit einer Verdopplungszeit (die Zeit, die eine Kultur von Mikroben braucht, um sich in Zellen pro Einheitsvolumen zu verdoppeln) von ungefähr 32 Stunden nicht besonders schnell . Durch die Verwendung des optimaleren Mediums MA2 kann diese auf 24 Stunden reduziert werden. Die Kultivierung erfolgt bei 42 °C unter weißem Fluoreszenzlicht mit einer ungefähren Intensität von 50 µmol Photonen m −2 s −1 (µE). Unter einer höheren Lichtintensität von 90 µE mit 5 % CO 2 , die durch Blasen zugeführt wird, kann jedoch die Wachstumsrate von C. merolae mit einer Verdopplungszeit von ungefähr 9,2 Stunden weiter gesteigert werden. Höheres Licht ist nicht unbedingt vorteilhaft, da oberhalb von 90 µE die Wachstumsrate abnimmt. Dies kann auf eine an der Photosynthesevorrichtung auftretende Photoschädigung zurückzuführen sein. C. merolae kann auch gezüchtet werden Gellangummi Platten zum Zwecke der Kolonieselektion oder Stamm Wartung im Labor. C. merolae ist ein obligat sauerstoffhaltiger Phototroph , dh er ist nicht in der Lage, festen Kohlenstoff aus seiner Umgebung aufzunehmen und muss auf sauerstoffhaltige Photosynthese angewiesen sein, um Kohlenstoff aus CO 2 zu binden .
Genom
Das Genom von C. merolae mit 16,5 Megabasenpaaren wurde 2004 sequenziert. Das reduzierte, extrem einfache, kompakte Genom besteht aus 20 Chromosomen und enthält 5.331 Gene, von denen 86,3% exprimiert und nur 26 Introns enthalten , die strikte Konsensussequenzen enthielten. Auffallend ist, dass das Genom von C. merolae nur 30 tRNA- Gene und eine äußerst geringe Anzahl von ribosomalen RNA- Genkopien enthält, wie in der Genomvergleichstabelle gezeigt . Die reduzierte Natur des Genoms hat zu mehreren anderen ungewöhnlichen Merkmalen geführt. Während die meisten Eukaryoten etwa 10 Kopien des Dynamins enthalten, das zum Quetschen von Membranen benötigt wird, um sich teilende Kompartimente zu trennen, enthält C. merolae nur zwei, eine Tatsache, die Forscher bei der Untersuchung der Organellenteilung ausgenutzt haben.
Obwohl es ein kleines Genom besitzt, enthält das Chloroplastengenom von C. merolae viele Gene, die in den Chloroplastengenomen anderer Algen und Pflanzen nicht vorhanden sind. Die meisten seiner Gene sind intronlos.
Molekularbiologie
Wie bei den meisten Modellorganismen wurden in C. merolae genetische Werkzeuge entwickelt . Diese umfassen Verfahren zur Isolierung von DNA und RNA aus C. merolae , die Einführung von DNA in C. merolae zur vorübergehenden oder stabilen Transformation und Verfahren zur Selektion, die einen Uracil-auxotrophen Stoff umfassen , der als Selektionsmarker verwendet werden kann.
DNA-Isolierung
Zur Isolierung von DNA aus C. merolae werden mehrere Verfahren verwendet, die von cyanobakteriellen Protokollen abgeleitet sind . Die erste ist eine heiße Phenolextraktion , die eine schnelle Extraktion ist, die verwendet werden kann, um DNA zu isolieren, die für die DNA-Amplifikations- Polymerase-Kettenreaktion (PCR) geeignet ist , wobei Phenol zu ganzen Zellen gegeben und bei 65 °C inkubiert wird, um DNA zu extrahieren. Wenn reinere DNA erforderlich ist, kann das Cetyl-Trimethyl-Ammoniumbromid- (CTAB)-Verfahren verwendet werden. Bei diesem Verfahren wird zuerst ein Extraktionspuffer mit hohem Salzgehalt aufgetragen und die Zellen werden aufgeschlossen, wonach ein Chloroform-Phenol-Gemisch verwendet wird, um die DNA bei Raumtemperatur zu extrahieren.
RNA-Isolierung
Gesamt-RNA kann aus C. merolae- Zellen unter Verwendung einer Variante des oben für DNA beschriebenen Heiß-Phenol-Verfahrens extrahiert werden .
Proteinextraktion
Wie bei DNA und RNA ist auch das Protokoll zur Proteinextraktion eine Adaption des Protokolls, das bei Cyanobakterien verwendet wird. Zellen werden unter Verwendung von Glaskügelchen und Vortexen in einem 10 % Glycerinpuffer , der das Reduktionsmittel DTT enthält, aufgebrochen, um Disulfidbindungen innerhalb von Proteinen aufzubrechen . Diese Extraktion führt zu denaturierten Proteinen , die in SDS-PAGE- Gelen für Western-Blotting und Coomassie- Färbung verwendet werden können.
Transformantenselektion und auxotrophe Linie von Uracil
C. merolae ist empfindlich gegenüber vielen Antibiotika, die üblicherweise zur Selektion erfolgreich transformierter Individuen im Labor verwendet werden, ist jedoch resistent gegen einige, insbesondere Ampicillin und Kanamycin .
Ein häufig verwendeter Selektionsmarker für die Transformation in C. merolae beinhaltet ein Uracil- auxotropher (erfordert exogenes Uracil). Die Mutante wurde durch Züchten von C. merolae in Gegenwart einer Verbindung, 5-FOA, entwickelt, die an sich nicht toxisch ist, aber durch ein Enzym im Uracil-Biosyntheseweg, Orotidin 5 ., in die toxische Verbindung 5-Fluorouracil umgewandelt wird ‚-monophosphate (OMP) Decarboxylase , durch die codierten Ura5.3 Gens. Zufällige Mutationen führten zu mehreren Mutanten mit Funktionsverlust in Ura5.3 , die es den Zellen ermöglichten, in Gegenwart von 5-FOA zu überleben, solange Uracil bereitgestellt wurde. Durch die Transformation dieser Mutante mit einem PCR-Fragment, das sowohl ein interessierendes Gen als auch eine funktionelle Kopie von Ura5.3 trägt , können Forscher bestätigen, dass das interessierende Gen in das Genom von C. merolae eingebaut wurde, wenn es ohne exogenes Uracil wachsen kann.
Polyethylenglykol (PEG) vermittelte transiente Expression
Während die chromosomale Integration von Genen eine stabile Transformante erzeugt, ermöglicht die vorübergehende Expression die Durchführung von Kurzzeitexperimenten unter Verwendung markierter oder modifizierter Gene in C. merolae . Eine vorübergehende Expression kann unter Verwendung eines auf Polyethylenglycol (PEG) basierenden Verfahrens in Protoplasten (Pflanzenzellen mit enzymatisch eliminierter starrer Zellwand ) erreicht werden, und da C. merolae keine Zellwand besitzt, verhält es sich für Transformationszwecke ähnlich wie ein Protoplast . Zur Transformation werden die Zellen kurz 30 % PEG mit der interessierenden DNA ausgesetzt, was zu einer vorübergehenden Transformation führt. Bei diesem Verfahren wird die DNA als zirkuläres Element aufgenommen und nicht in das Genom des Organismus integriert, da keine homologen Bereiche zur Integration vorhanden sind.
Gen-Targeting
Um eine stabile mutierte Linie zu erzeugen, kann Gen-Targeting verwendet werden, um ein interessierendes Gen über homologe Rekombination an einer bestimmten Stelle des C. merolae- Genoms einzufügen . Durch Einfügen von DNA-Regionen von mehreren hundert Basenpaaren Länge an den Enden des interessierenden Gens, die komplementär zu einer Sequenz innerhalb des C. merolae- Genoms sind, kann die eigene DNA-Reparaturmaschinerie des Organismus verwendet werden, um das Gen an diesen Regionen einzufügen. Hier kann das gleiche Transformationsverfahren wie für die transiente Expression verwendet werden, außer mit den homologen DNA-Segmenten, um die Genomintegration zu ermöglichen.
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Studium der Zell- und Organellenteilungen
Das extrem einfache Divisom, die einfache Zellarchitektur und die Fähigkeit, Teilungen in C. merolae zu synchronisieren, machen es zum perfekten Organismus für das Studium der Mechanismen der eukaryotischen Zell- und Organellenteilung. Die Synchronisation der Teilung von Organellen in kultivierten Zellen kann sehr einfach sein und beinhaltet normalerweise die Verwendung von Hell-Dunkel-Zyklen. Der chemische Wirkstoff Aphidicolin kann hinzugefügt werden, um die Chloroplastenteilung einfach und effektiv zu synchronisieren. Der Peroxisomenteilungsmechanismus wurde erstmals mit C. merolae als System ermittelt, bei dem die Peroxisomenteilung zusätzlich zu Hell-Dunkel-Zyklen mit dem Mikrotubuli- störenden Wirkstoff Oryzalin synchronisiert werden kann .
Photosyntheseforschung
C. merolae wird auch zur Erforschung der Photosynthese verwendet . Bemerkenswert ist, dass die Zusammensetzung der Untereinheiten der Photosysteme in C. merolae einige signifikante Unterschiede zu denen anderer verwandter Organismen aufweist. Das Photosystem II (PSII) von C. merolae hat erwartungsgemäß einen besonders ungewöhnlichen pH-Bereich, in dem es funktionieren kann. Trotz der Tatsache, dass der Mechanismus von PSII eine schnelle Freisetzung von Protonen erfordert und Lösungen mit niedrigerem pH die Fähigkeit dazu verändern sollten, ist C. merolae PSII in der Lage, Wasser mit der gleichen Geschwindigkeit wie andere verwandte Spezies auszutauschen und zu spalten.
Siehe auch
Externe Links
Guiry, MD; Guiry, GM (2008). "' Cyanidioschyzon merolae' " . AlgenBase . Weltweite elektronische Publikation, National University of Ireland, Galway.