Gezielte Differenzierung - Directed differentiation
Die gerichtete Differenzierung ist eine biotechnologische Methodik an der Schnittstelle von Stammzellbiologie , Entwicklungsbiologie und Tissue Engineering . Es nutzt im Wesentlichen das Potenzial von Stammzellen, indem es ihre Differenzierung in vitro in Richtung eines bestimmten Zelltyps oder Gewebes von Interesse einschränkt . Stammzellen sind per Definition pluripotent und können sich in verschiedene Zelltypen wie Neuronen , Kardiomyozyten , Hepatozyten usw. differenzieren . Eine effiziente gezielte Differenzierung erfordert ein detailliertes Verständnis der Abstammungs- und Zellschicksalsentscheidung , die oft von der Entwicklungsbiologie bereitgestellt wird.
Konzeptioneller Rahmen
Während der Differenzierung treffen pluripotente Zellen eine Reihe von Entwicklungsentscheidungen, um zuerst die drei Keimblätter ( Ektoderm , Mesoderm und Endoderm ) des Embryos und der intermediären Vorläufer zu erzeugen , gefolgt von weiteren Entscheidungen oder Kontrollpunkten, die alle reifen Gewebe des Körpers hervorbringen. Der Differenzierungsprozess kann als Folge binärer Entscheidungen basierend auf probabilistischen oder stochastischen Modellen modelliert werden. Die Entwicklungsbiologie und Embryologie vermittelt das grundlegende Wissen über die Differenzierung der Zelltypen durch Mutationsanalyse , Abstammungsverfolgung, Embryo-Mikromanipulation und Genexpressionsstudien . Zelldifferenzierung und Gewebeorganogenese beinhalten eine begrenzte Anzahl von Entwicklungssignalwegen . Es ist daher möglich, das Zellschicksal zu steuern, indem Zellentscheidungen durch extrazelluläre Signalgebung gesteuert werden, die Entwicklungssignale nachahmt.
Quellenmaterial
Die gerichtete Differenzierung wird hauptsächlich auf pluripotente Stammzellen (PSCs) von Säugetieren, insbesondere Maus- und Humanzellen, für biomedizinische Forschungsanwendungen angewendet . Seit der Entdeckung embryonaler Stammzellen (ES) (1981) und induzierter pluripotenter Stammzellen (iPS) (2006) ist das Quellenmaterial potenziell unbegrenzt. Historisch wurden auch embryonale Karzinomzellen (EC) verwendet. Fibroblasten oder andere differenzierte Zelltypen wurden für direkte Reprogrammierungsstrategien verwendet .
Methoden
Die Zelldifferenzierung beinhaltet einen Übergang von einem proliferativen Modus zum Differenzierungsmodus. Die gerichtete Differenzierung besteht in der Nachahmung von Entwicklungsentscheidungen (Entwicklung des Embryos) in vitro unter Verwendung der Stammzellen als Ausgangsmaterial. Zu diesem Zweck werden pluripotente Stammzellen (PSCs) unter kontrollierten Bedingungen mit spezifischen Substraten oder extrazellulären Matrices kultiviert, die die Zelladhäsion und -differenzierung fördern, und definieren Kulturmedienzusammensetzungen . Eine begrenzte Anzahl von Signalfaktoren wie Wachstumsfaktoren oder kleine Moleküle , die die Zelldifferenzierung kontrollieren, wird sequentiell oder kombinatorisch mit unterschiedlicher Dosierung und Expositionszeit verabreicht. Die richtige Differenzierung des interessierenden Zelltyps wird durch Analysieren von zelltypspezifischen Markern , Genexpressionsprofilen und funktionellen Assays verifiziert .
Frühe Methoden
- Co-Kultur mit Stromazellen oder Feederzellen und auf spezifischen Kultursubstraten:
Stützzellen und Matrizen liefern entwicklungsähnliche Umweltsignale.
- 3D-Zellaggregatbildung, sogenannte Embryoid Bodies (EBs): Das Aggregat zielt darauf ab, die frühe Embryonalentwicklung nachzuahmen und die Zelldifferenzierung anzuleiten .
- Kultur in Gegenwart von fötalem Rinderserum , Entfernung von Pluripotenzfaktoren.
Aktuelle Methoden
Gezielte Differenzierung
Dieses Verfahren besteht darin, die Zellen spezifischen Signalweg-Modulatoren auszusetzen und die Zellkulturbedingungen (umweltbedingt oder exogen) zu manipulieren, um die natürliche Abfolge von Entwicklungsentscheidungen zur Herstellung eines bestimmten Zelltyps/Gewebes nachzuahmen. Ein Nachteil dieses Ansatzes ist die Notwendigkeit, ein gutes Verständnis dafür zu haben, wie der interessierende Zelltyp gebildet wird.
Direkte Umprogrammierung
Diese Methode, auch Transdifferenzierung oder direkte Konversion genannt, besteht darin, einen oder mehrere in die Zellen eingebrachte Faktoren, meist Transkriptionsfaktoren, zu überexprimieren. Das Ausgangsmaterial können entweder pluripotente Stammzellen (PSCs) oder differenzierte Zelltypen wie Fibroblasten sein. Das Prinzip wurde erstmals 1987 mit den myogenen Faktoren MyoD nachgewiesen. Ein Nachteil dieses Ansatzes ist die Einführung fremder Nukleinsäure in die Zellen und die erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren, deren Wirkungen nicht vollständig verstanden werden.
Abstammungs-/zelltypspezifische Auswahl
Diese Methode besteht darin, den interessierenden Zelltyp auszuwählen, normalerweise mit Antibiotikaresistenz . Zu diesem Zweck werden die Zellen des Ausgangsmaterials so modifiziert, dass sie eine Antibiotikaresistenzkassette unter einem für den Zielzelltyp spezifischen Promotor enthalten . Nur Zellen, die der interessierenden Abstammungslinie verpflichtet sind, überleben die Selektion .
Anwendungen
Die gerichtete Differenzierung bietet eine potenziell unbegrenzte und manipulierbare Quelle für Zellen und Gewebe. Einige Anwendungen werden durch den unreifen Phänotyp des von pluripotenten Stammzellen (PSCs) abgeleiteten Zelltyps beeinträchtigt, was die physiologischen und funktionellen Studien einschränkt. Es entstanden mehrere Anwendungsdomänen:
Modellsystem für die Grundlagenwissenschaften
Für die Grundlagenwissenschaften , insbesondere die Entwicklungsbiologie und Zellbiologie , ermöglichen PSC- abgeleitete Zellen die Untersuchung grundlegender Fragen auf molekularer und zellulärer Ebene in vitro, die ansonsten aus technischen und ethischen Gründen in vivo äußerst schwierig oder unmöglich zu untersuchen gewesen wären, wie z Entwicklung des Menschen. Insbesondere differenzierende Zellen eignen sich für quantitative und qualitative Studien. Komplexere Prozesse auch in vitro und die Bildung von Organoiden, einschließlich cerebroids, untersucht werden können Exkavation und Niere wurden beschrieben.
Wirkstoffforschung und Toxikologie
Aus pluripotenten Stammzellen (PSCs) differenzierte Zelltypen werden als präklinische In-vitro-Modelle für menschliche Erkrankungen evaluiert . Humane Zelltypen in einer Schale bieten eine Alternative zu herkömmlichen präklinischen Assays mit tierischen, menschlichen immortalisierten Zellen oder Primärkulturen aus Biopsien , die ihre Grenzen haben. Klinisch relevante Zelltypen, dh bei Krankheiten betroffene Zelltypen, sind ein Schwerpunkt der Forschung, dazu gehören Hepatozyten , Beta-Zellen der Langerhans - Inseln , Kardiomyozyten und Neuronen . Drug Screening werden an miniaturisierten Zellkulturen in Multiwell-Platten oder auf einem Chip durchgeführt.
Krankheitsmodellierung
PSCs-abgeleitete Zellen von Patienten werden in vitro verwendet, um spezifische Pathologien nachzubilden. Der spezifische Zelltyp, der in der Pathologie betroffen ist, ist die Basis des Modells. Zum Beispiel werden Motoneuronen verwendet, um spinale Muskelatrophie (SMA) zu untersuchen, und Kardiomyozyten werden verwendet, um Arrhythmien zu untersuchen . Dies kann ein besseres Verständnis der Pathogenese und die Entwicklung neuer Behandlungsmethoden durch die Wirkstoffforschung ermöglichen. Unreife PSC-abgeleitete Zelltypen können in vitro durch verschiedene Strategien gereift werden, wie beispielsweise in vitro Alterung , um altersbedingte Erkrankungen in vitro zu modellieren. Die wichtigsten Krankheiten, die mit PSCs-abgeleiteten Zellen modelliert werden, sind Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Alzheimer (AD), Parkinson (PD), Fragiles-X-Syndrom (FXS), Huntington-Krankheit (HD), Down-Syndrom , Spinale Muskelatrophie (SMA), Muskeldystrophien , Mukoviszidose , Long-QT-Syndrom und Typ-I-Diabetes .
Regenerative Medizin
Die potenziell unbegrenzte Quelle von Zellen und Geweben kann direkt für Tissue Engineering , Zellersatz und Transplantation nach akuten Verletzungen und rekonstruktiven Operationen verwendet werden . Diese Anwendungen beschränken sich auf die Zelltypen, die mit der richtigen Organogenese effizient und sicher von humanen PSCs unterschieden werden können . Dezellularisierte Organe werden auch als Gewebegerüst für die Organogenese verwendet. Ausgangsmaterial können normale gesunde Zellen eines anderen Spenders (heterologe Transplantation) oder genetisch korrigierte Zellen desselben Patienten (autologe) sein. Bedenken hinsichtlich der Patientensicherheit wurden aufgrund der Möglichkeit einer Kontamination undifferenzierter Zellen geäußert. Die erste klinische Studie mit von hESC abgeleiteten Zellen fand 2011 statt. Die erste klinische Studie mit von hiPSC abgeleiteten Zellen begann 2014 in Japan.