Fed-Batch-Kultur - Fed-batch culture

Symbol für Fed-Batch-Reaktor

Fed-Batch-Kultur ist im weitesten Sinne definiert als eine Betriebstechnik in biotechnologischen Prozessen, bei der dem Bioreaktor während der Kultivierung ein oder mehrere Nährstoffe (Substrate) zugeführt (zugeführt) werden und das/die Produkt(e) im Bioreaktor verbleiben, bis das Ende des Laufs. Eine alternative Beschreibung des Verfahrens ist die einer Kultur, bei der "ein Basismedium die anfängliche Zellkultur unterstützt und ein Zufuhrmedium zugegeben wird, um eine Nährstoffverarmung zu verhindern". Es ist auch eine Art von Semi-Batch-Kultur . In einigen Fällen werden alle Nährstoffe in den Bioreaktor eingespeist. Der Vorteil der Fed-Batch-Kultur besteht darin, dass man die Konzentration des Fed-Substrats in der Kulturflüssigkeit auf willkürlich gewünschte Niveaus (in vielen Fällen auf niedrige Niveaus) steuern kann.

Im Allgemeinen ist die Fed-Batch-Kultur der konventionellen Batch-Kultur überlegen, wenn die Kontrolle der Konzentrationen eines Nährstoffs (oder der Nährstoffe) die Ausbeute oder Produktivität des gewünschten Metaboliten beeinflusst.

Arten von Bioprozessen

Die Arten von Bioprozessen, für die Fed-Batch-Kulturen wirksam sind, lassen sich wie folgt zusammenfassen:

1. Substrathemmung ^[1]

Nährstoffe wie Methanol, Ethanol, Essigsäure und aromatische Verbindungen hemmen das Wachstum von Mikroorganismen bereits in relativ geringen Konzentrationen. Durch geeignete Zugabe solcher Substrate kann die Verzögerungszeit verkürzt und die Hemmung des Zellwachstums deutlich reduziert werden.

2. Hohe Zelldichte (Hohe Zellkonzentration) ^[1]

Um in einer Batch-Kultur sehr hohe Zellkonzentrationen zu erreichen, zB 50-100 g Trockenzellen/l, werden hohe Anfangskonzentrationen der Nährstoffe im Medium benötigt. Bei solch hohen Konzentrationen werden die Nährstoffe hemmend, obwohl sie bei den normalen Konzentrationen, die in Batch-Kulturen verwendet werden, keine solche Wirkung haben.

3. Glukose-Effekt ( Crabtree-Effekt ) ^[1]

Bei der Herstellung von Bäckerhefe aus Malzwürze oder Melasse ist seit Anfang des 20. Jahrhunderts bekannt, dass Ethanol auch in Gegenwart von ausreichend gelöstem Sauerstoff (DO) entsteht, wenn ein Zuckerüberschuss in der Kulturflüssigkeit vorhanden ist. Ethanol ist eine der Hauptursachen für eine geringe Zellausbeute. Die aerobe Ethanolbildung in Gegenwart einer Glucosekonzentration ist als Glucoseeffekt oder Crabtree-Effekt bekannt. Um diesen Effekt zu reduzieren, wird bei der Bäckerhefeherstellung in der Regel ein Fed-Batch-Verfahren eingesetzt. In aeroben Kulturen von Escherichia coli und Bacillus subtilis werden organische Säuren wie Essigsäure (und in geringeren Mengen Milchsäure und Ameisensäure) als Nebenprodukte produziert, wenn die Zuckerkonzentration hoch ist, und diese Säuren hemmen das Zellwachstum sowie verschlechternde Wirkung auf die Stoffwechselaktivitäten. Die Bildung dieser Säuren wird als bakterieller Crabtree-Effekt bezeichnet.

4. Katabolitenrepression ^[1]

Wenn ein Mikroorganismus mit einer schnell metabolisierbaren Kohlenstoff-Energiequelle, wie Glukose, ausgestattet wird, führt die resultierende Erhöhung der intrazellulären Konzentration von ATP zur Unterdrückung der Biosynthese von Enzymen, wodurch eine langsamere Metabolisierung der Energiequelle verursacht wird. Dieses Phänomen wird als Katabolitrepression bezeichnet. Viele Enzyme, insbesondere solche, die an katabolen Stoffwechselwegen beteiligt sind, unterliegen dieser repressiven Regulation. Ein wirksames Verfahren zur Überwindung der Katabolitrepression bei der Enzymbiosynthese ist eine Fed-Batch-Kultur, bei der die Glucosekonzentration in der Kulturflüssigkeit niedrig gehalten wird, das Wachstum eingeschränkt ist und die Enzymbiosynthese dereprimiert wird. Die langsame Zufuhr von Glucose bei der Penicillin-Fermentation durch Penicillium chrysogenum ist ein klassisches Beispiel in dieser Kategorie.

5. Auxotrophe Mutanten ^[1]

In einem mikrobiellen Verfahren, bei dem eine auxotrophe Mutante (eine ernährungsbedürftige Mutante) verwendet wird, führt eine Überversorgung mit dem erforderlichen Nährstoff zu einem reichlichen Zellwachstum mit einer geringen Akkumulation des gewünschten Metaboliten aufgrund von Rückkopplungshemmung und/oder Endproduktrepression. Ein Mangel an dem benötigten Nährstoff verringert jedoch das Zellwachstum sowie die Gesamtproduktion des gewünschten Metaboliten, da die Produktionsrate normalerweise proportional zur Zellkonzentration ist. In einem solchen Bioprozess kann die Akkumulation des gewünschten Metaboliten maximiert werden, indem die Mutante auf einer begrenzten Menge des benötigten Nährstoffs gezüchtet wird. Um die Mutante auf einer niedrigen Konzentration des benötigten Nährstoffs zu kultivieren, wird sie der Batch-Kultur mit einer kontrollierten Rate zugeführt. Diese Technik wird häufig bei der industriellen Aminosäureproduktion mit den auxotrophen Mutanten verwendet. Ein Beispiel ist die Lysinproduktion, wobei die Homoserin- oder Threonin/Methionin-benötigende Mutante von Corynebacterium glutamicum für das Homoserin-Dehydrogenase-Gen fehlt.

6. Expressionskontrolle eines Gens mit einem reprimierbaren Promotor

Die Transkription eines Gens mit einem reprimierbaren Promotor stromaufwärts des offenen Leserasters wird durch Kombination des sogenannten Holorepressors mit der Operatorregion auf der DNA reprimiert. Wenn eine bestimmte chemische Verbindung in der Kulturflüssigkeit vorhanden ist, verbindet sich die Verbindung (oder ihr Metabolit) in den Zellen als Corepressor mit einem Apo-Repressor (einer Art Transkriptionsfaktor), um den Holorepressor zu bilden. Das Halten der Konzentration dieser Verbindung so gering wie möglich (während noch ein ausreichendes Zellwachstum ermöglicht wird) ermöglicht eine fortgesetzte Expression des regulierten Gens. Die Fed-Batch-Kultur ist hierfür eine leistungsfähige Technik. Beispiele für den reprimierbaren Promotor sind der trp- Promotor und der phoA- Promotor.

7. Verlängerung der Betriebszeit, Ergänzung des durch Verdunstung verlorenen Wassers und Verringerung der Viskosität der Kulturbrühe ^[1]

Arten von Kulturstrategien

Kultur mit hoher Zelldichte

Die Fed-Batch-Strategie wird typischerweise in bioindustriellen Prozessen verwendet, um eine hohe Zelldichte im Bioreaktor zu erreichen . Meist ist die Zufuhrlösung hochkonzentriert, um eine Verdünnung des Bioreaktors zu vermeiden. Die Produktion von heterologen Proteinen durch Fed-Batch-Kulturen rekombinanter Mikroorganismen wurde ausführlich untersucht.

Die kontrollierte Zugabe des Nährstoffs beeinflusst direkt die Wachstumsrate der Kultur und hilft einen Überlauf des Stoffwechsels zu vermeiden (Bildung von Nebenmetaboliten wie Acetat bei Escherichia coli , Milchsäure in Säugetierzellkulturen, Ethanol bei Saccharomyces cerevisiae ), Sauerstofflimitierung (Anaerobiose) ).

Constant-Feed-Batch-Kultur

Die einfachste Fed-Batch-Kultur ist diejenige, bei der die Zufuhrrate eines wachstumslimitierenden Substrats konstant ist, dh die Zufuhrrate ist während der Kultur invariant. Dieser Fall ist in der Grafik dargestellt (hier ist das Kulturvolumen variabel). Diese Art der Fed-Batch-Kultur wird als Constant-Fed-Batch-Kultur (CFBC) bezeichnet und ist mathematisch und experimentell gut etabliert. Bei der CFBC wurden beide Fälle von CFBC mit festem Volumen und CFBC mit variablem Volumen untersucht.

Die Grafik zeigt das Prinzip einer substratlimitierten Fed-Batch-Kultivierung mit einer initialen Batch-Phase. Nach Verbrauch des Ausgangssubstrats wird eine kontinuierliche und konstante Zufuhr des Substrats gestartet.

Exponential-Fed-Batch-Kultur

Unter idealen Bedingungen wachsen Zellen exponentiell. Wird die Zufuhrrate des wachstumslimitierenden Substrats proportional zur exponentiellen Wachstumsrate der Zellen erhöht, ist es möglich, die spezifische Wachstumsrate der Zellen über einen langen Zeitraum aufrechtzuerhalten, während die Substratkonzentration in der Kulturflüssigkeit konstant gehalten wird Niveau. Die erforderliche Zufuhrrate (volumetrisch oder Masse) muss mit der Zeit exponentiell erhöht werden, so dass diese Art der Fed-Batch-Kultur als Exponential-Fed-Batch-Kultur (EFBC) bezeichnet wird.

Die Substratlimitierung bietet die Möglichkeit, die Reaktionsgeschwindigkeiten zu kontrollieren, um technologische Einschränkungen im Zusammenhang mit der Kühlung des Reaktors und dem Sauerstofftransfer zu vermeiden. Die Substratlimitierung ermöglicht auch die metabolische Kontrolle, um osmotische Effekte, Katabolitrepression und Überlaufmetabolismus von Nebenprodukten zu vermeiden .

Regelstrategie

Um das Wachstum in einem Fed-Batch-Prozess zu kontrollieren, können verschiedene Strategien verwendet werden:

Verweise