Fluoreszierendes Etikett - Fluorescent tag
In der Molekularbiologie und Biotechnologie ist ein Fluoreszenzmarker , auch als Fluoreszenzmarker oder Fluoreszenzsonde bekannt , ein Molekül , das chemisch angehängt wird, um den Nachweis eines Biomoleküls wie eines Proteins, Antikörpers oder einer Aminosäure zu unterstützen. Im Allgemeinen verwendet Fluoreszenzmarkierung oder Markierung ein reaktives Derivat eines Fluoreszenzmoleküls, das als Fluorophor bekannt ist . Der Fluorophor bindet selektiv an eine spezifische Region oder funktionelle Gruppe des Zielmoleküls und kann chemisch oder biologisch angelagert werden. Verschiedene Markierungstechniken wie enzymatische Markierung, Proteinmarkierung und genetische Markierung werden weithin verwendet. Ethidiumbromid , Fluorescein und grün fluoreszierendes Protein sind übliche Markierungen. Die am häufigsten markierten Moleküle sind Antikörper, Proteine, Aminosäuren und Peptide, die dann als spezifische Sonden zum Nachweis eines bestimmten Ziels verwendet werden.
Geschichte
Die Entwicklung von Methoden zum Nachweis und zur Identifizierung von Biomolekülen wurde durch die Fähigkeit motiviert, die Untersuchung molekularer Strukturen und Wechselwirkungen zu verbessern. Vor dem Aufkommen der Fluoreszenzmarkierung wurden Radioisotope verwendet, um molekulare Verbindungen nachzuweisen und zu identifizieren. Seitdem wurden sicherere Verfahren entwickelt, bei denen Fluoreszenzfarbstoffe oder fluoreszierende Proteine als Markierungen oder Sonden verwendet werden, um Biomoleküle zu markieren und zu identifizieren. Obwohl die Fluoreszenzmarkierung in dieser Hinsicht erst seit kurzem verwendet wird, gibt es die Entdeckung der Fluoreszenz schon viel länger.
Sir George Stokes entwickelte 1852 das Stokes-Fluoreszenzgesetz, das besagt, dass die Wellenlänge der Fluoreszenzemission größer ist als die der anregenden Strahlung. Richard Meyer bezeichnete dann 1897 Fluorophor , um eine chemische Gruppe zu beschreiben, die mit Fluoreszenz verbunden ist. Seitdem wurde Fluorescein 1871 von Adolph von Baeyer als Fluoreszenzfarbstoff entwickelt und die Färbemethode wurde 1911 mit der Entwicklung der Fluoreszenzmikroskopie entwickelt und verwendet .
Ethidiumbromid und Varianten wurden in den 1950er Jahren entwickelt und 1994 wurden fluoreszierende Proteine oder FPs eingeführt. Grün fluoreszierendes Protein oder GFP wurde entdeckt , Osamu Shimomura in den 1960er Jahren und wurde als Tracer - Molekül durch Douglas Prasher 1987 FPs führte zu einem Durchbruch von lebender entwickelte Zell Bildgebung mit der Fähigkeit zur selektiven genetischen Markierung Proteinregionen und Proteinfunktionen und Mechanismen beobachten . Für diesen Durchbruch wurde Shimomura 2008 der Nobelpreis verliehen.
Neue Methoden zur Verfolgung von Biomolekülen wurden entwickelt, einschließlich der Verwendung von kolorimetrischen Biosensoren, photochromen Verbindungen, Biomaterialien und elektrochemischen Sensoren. Fluoreszenzmarkierung ist auch ein übliches Verfahren, bei dem sich die Anwendungen auf enzymatische Markierung, chemische Markierung, Proteinmarkierung und genetische Markierung ausgeweitet haben .
Methoden zum Tracking von Biomolekülen
Derzeit gibt es mehrere Markierungsmethoden, um Biomoleküle zu verfolgen. Einige der Methoden umfassen die folgenden.
Isotopenmarker
Häufige Spezies, für die Isotopenmarker verwendet werden, umfassen Proteine. In diesem Fall werden Aminosäuren mit stabilen Isotopen von entweder Kohlenstoff, Stickstoff oder Wasserstoff in Polypeptidsequenzen eingebaut. Diese Polypeptide werden dann einer Massenspektrometrie unterzogen . Aufgrund der genau definierten Änderung, die diese Isotope an den Peptiden vornehmen, ist es möglich, durch die Spektrometrie-Grafik zu erkennen, welche Peptide die Isotope enthielten. Auf diese Weise kann man das interessierende Protein von mehreren anderen in einer Gruppe extrahieren. Isotopenverbindungen spielen eine wichtige Rolle als Photochrome, die unten beschrieben werden.
Kolorimetrische Biosensoren
Biosensoren werden an einer interessierenden Substanz angebracht. Normalerweise könnte diese Substanz kein Licht absorbieren, aber mit dem angeschlossenen Biosensor kann Licht absorbiert und auf einem Spektrophotometer emittiert werden . Darüber hinaus können fluoreszierende Biosensoren mit bloßem Auge betrachtet werden. Einige fluoreszierende Biosensoren haben auch die Fähigkeit, die Farbe in wechselnden Umgebungen zu ändern (z. B. von Blau nach Rot). Ein Forscher wäre in der Lage, die Umgebung zu untersuchen und Daten über die Umgebung zu erhalten, basierend auf der Farbe, die er oder sie von der Biosensor-Molekül-Hybridspezies sichtbar sehen könnte.
Kolorimetrische Assays werden normalerweise verwendet, um zu bestimmen, wie hoch die Konzentration einer Spezies im Verhältnis zu einer anderen ist.
Photochrome Verbindungen
Photochrome Verbindungen haben die Fähigkeit, zwischen einem Bereich oder einer Vielzahl von Farben zu wechseln. Ihre Fähigkeit, unterschiedliche Farben darzustellen, liegt darin, wie sie Licht absorbieren. Verschiedene isomere Manifestationen des Moleküls absorbieren verschiedene Wellenlängen des Lichts, sodass jede isomere Spezies basierend auf ihrer Absorption eine andere Farbe aufweisen kann. Dazu gehören photoschaltbare Verbindungen, bei denen es sich um Proteine handelt, die in einer bestimmten Umgebung von einem nicht fluoreszierenden Zustand in einen fluoreszierenden Zustand wechseln können.
Das gebräuchlichste organische Molekül, das als Photochrom verwendet wird, ist Diarylethen . Andere Beispiele für photoschaltbare Proteine sind PADRON-C, rs-FastLIME-s und bs-DRONPA-s, die in Pflanzen- und Säugetierzellen gleichermaßen verwendet werden können, um zu beobachten, wie sich Zellen in unterschiedliche Umgebungen bewegen.
Biomaterialien
Fluoreszierende Biomaterialien sind eine Möglichkeit, externe Faktoren zu nutzen, um einen Pfad sichtbarer zu beobachten. Das Verfahren beinhaltet die Fluoreszenzmarkierung von Peptidmolekülen, die den natürlichen Weg eines Organismus verändern würden. Wenn dieses Peptid in die Zelle des Organismus eingefügt wird, kann es eine andere Reaktion auslösen. Diese Methode kann zum Beispiel verwendet werden, um einen Patienten zu behandeln und dann das Ergebnis der Behandlung sichtbar zu sehen.
Elektrochemische Sensoren
Elektrochemische Sensoren können zur markierungsfreien Erfassung von Biomolekülen verwendet werden. Sie erkennen Veränderungen und messen den Strom zwischen einer sondierten Metallelektrode und einem Elektrolyten, der den Zielanalyten enthält. Aus einem Rückkopplungsstrom wird dann ein bekanntes Potential an die Elektrode angelegt und der resultierende Strom kann gemessen werden. Zum Beispiel umfasst eine Technik, die elektrochemisches Erfassen verwendet, das langsame Erhöhen der Spannung, was bewirkt, dass chemische Spezies an der Elektrode oxidiert oder reduziert werden. Der Zellstrom gegen die Spannung wird aufgetragen, was letztendlich die Menge der an der Elektrode verbrauchten oder produzierten chemischen Spezies identifizieren kann. Fluoreszierende Tags können in Verbindung mit elektrochemischen Sensoren verwendet werden, um den Nachweis in einem biologischen System zu erleichtern.
Fluoreszierende Etiketten
Von den verschiedenen Verfahren zur Markierung von Biomolekülen sind fluoreszierende Markierungen insofern vorteilhaft, als sie selbst bei niedriger Konzentration hochempfindlich sind und die Faltung und Funktion des Zielmoleküls nicht zerstören.
Grün fluoreszierendes Protein ist ein natürlich vorkommendes fluoreszierendes Protein aus der Qualle Aequorea victoria , das häufig verwendet wird, um interessierende Proteine zu markieren. GFP emittiert bei Anregung durch Lichtabsorption ein Photon im grünen Bereich des Lichtspektrums. Der Chromophor besteht aus einem oxidierten Tripeptid -Ser^65-Tyr^66-Gly^67, das sich in einem β-Fass befindet. GFP katalysiert die Oxidation und benötigt nur molekularen Sauerstoff. GFP wurde modifiziert, indem die Wellenlänge des absorbierten Lichts geändert wurde, um andere Fluoreszenzfarben aufzunehmen. Beispiele für GFP-Varianten sind YFP oder gelb fluoreszierendes Protein , BFP oder blau fluoreszierendes Protein und CFP oder cyan fluoreszierendes Protein . Diese Varianten werden durch die Gentechnik des GFP-Gens hergestellt.
Als Fluoreszenzmarker können auch synthetische Fluoreszenzsonden verwendet werden. Zu den Vorteilen dieser Etiketten gehören eine kleinere Größe mit mehr Farbvielfalt. Sie können verwendet werden, um interessierende Proteine durch verschiedene Verfahren selektiver zu markieren, einschließlich Markierung auf der Grundlage von chemischer Erkennung, wie die Verwendung von metallchelatbildenden Peptid-Tags, und Markierung auf Grundlage von biologischer Erkennung unter Verwendung enzymatischer Reaktionen. Trotz ihres breiten Spektrums an Anregungs- und Emissionswellenlängen sowie ihrer besseren Stabilität neigen synthetische Sonden jedoch dazu, für die Zelle toxisch zu sein und werden daher im Allgemeinen nicht in Zellbildgebungsstudien verwendet.
Fluoreszierende Markierungen können an mRNA hybridisiert werden, um Interaktion und Aktivität, wie z. B. die mRNA-Lokalisierung, sichtbar zu machen. Ein mit der fluoreszierenden Sonde markierter Antisense-Strang wird an einen einzelnen mRNA-Strang angehängt und kann dann während der Zellentwicklung betrachtet werden, um die Bewegung der mRNA innerhalb der Zelle zu sehen.
Fluorogene Etiketten
Ein Fluorogen ist ein Ligand (fluorogener Ligand), der selbst nicht fluoreszierend ist, aber wenn er an ein spezifisches Protein oder eine RNA-Struktur gebunden wird, fluoresziert.
Zum Beispiel FAST ist eine Variante des photoaktiven gelben Proteins , die chemische Mimetika des GFP - Chromophors Tripeptid zu binden , entwickelt wurde. Ebenso ist das Spinat-Aptamer eine konstruierte RNA-Sequenz, die chemische Nachahmer von GFP-Chromophoren binden kann, wodurch RNA-Molekülen, die die Sequenz enthalten, bedingte und reversible Fluoreszenz verliehen wird.
Verwendung von Tags bei der Fluoreszenzmarkierung
Fluoreszenzmarkierung ist für ihre zerstörungsfreie Natur und hohe Empfindlichkeit bekannt. Dies hat es zu einer der am weitesten verbreiteten Methoden zur Markierung und Verfolgung von Biomolekülen gemacht. Abhängig von der Art des Ziels können verschiedene Techniken der Fluoreszenzmarkierung verwendet werden.
Enzymatische Markierung
Bei der enzymatischen Markierung wird zunächst ein DNA-Konstrukt unter Verwendung eines Gens und der DNA eines fluoreszierenden Proteins gebildet. Nach der Transkription wird eine Hybrid-RNA + Fluoreszenz gebildet. Das interessierende Objekt ist an ein Enzym gebunden, das diese Hybrid-DNA erkennen kann. Als Fluorophor wird in der Regel Fluorescein verwendet.
Chemische Kennzeichnung
Die chemische Markierung oder die Verwendung chemischer Tags nutzt die Wechselwirkung zwischen einem kleinen Molekül und einer spezifischen genetischen Aminosäuresequenz. Als Alternative zu GFP wird manchmal eine chemische Kennzeichnung verwendet. Synthetische Proteine, die als fluoreszierende Sonden fungieren, sind kleiner als GFPs und können daher in einer breiteren Vielfalt von Situationen als Sonden fungieren. Darüber hinaus bieten sie ein breiteres Spektrum an Farben und photochemischen Eigenschaften. Mit den jüngsten Fortschritten in der chemischen Markierung werden chemische Tags gegenüber fluoreszierenden Proteinen aufgrund der architektonischen und Größenbeschränkungen des charakteristischen β-Fass des fluoreszierenden Proteins bevorzugt. Veränderungen von fluoreszierenden Proteinen würden zu einem Verlust der fluoreszierenden Eigenschaften führen.
Proteinmarkierung
Die Proteinmarkierung verwendet ein kurzes Tag, um die Störung der Proteinfaltung und -funktion zu minimieren. Übergangsmetalle werden verwendet, um spezifische Reste in den Tags mit ortsspezifischen Zielen wie den N-Termini, C-Termini oder internen Stellen innerhalb des Proteins zu verknüpfen. Beispiele für Tags, die zur Proteinmarkierung verwendet werden, umfassen biarsenische Tags, Histidin-Tags und FLAG-Tags.
Genetische Kennzeichnung
Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist ein Beispiel für eine genetische Markierungstechnik, die Sonden verwendet, die für chromosomale Stellen entlang der Länge eines Chromosoms spezifisch sind, auch bekannt als Chromosomenmalerei . Mehrere Fluoreszenzfarbstoffe, die jeweils eine unterschiedliche Anregungs- und Emissionswellenlänge aufweisen, werden an eine Sonde gebunden, die dann an Chromosomen hybridisiert wird. Ein Fluoreszenzmikroskop kann die vorhandenen Farbstoffe erkennen und an einen Computer senden, der den Karyotyp einer Zelle aufdecken kann. Diese Technik ermöglicht es, Anomalien wie Deletionen und Duplikationen aufzudecken.
Zellbildgebung
Chemische Tags wurden stärker auf Bildgebungstechnologien zugeschnitten als fluoreszierende Proteine, da chemische Tags Photosensibilisatoren näher an den Zielproteinen lokalisieren können. Proteine können dann mit Bildgebung wie Super-Resolution-Mikroskopie , Ca 2+ -Bildgebung , pH-Erfassung, Wasserstoffperoxid-Detektion, chromophorunterstützter Lichtinaktivierung und Multiphotonen-Lichtmikroskopie markiert und nachgewiesen werden . In-vivo- Bildgebungsstudien an lebenden Tieren wurden zum ersten Mal unter Verwendung eines monomeren Proteins durchgeführt, das aus der bakteriellen Haloalkan-Dehalogenase, bekannt als Halo-Tag, stammt. Der Halo-Tag verbindet sich kovalent mit seinem Liganden und ermöglicht eine bessere Expression löslicher Proteine.
Vorteile
Obwohl Fluoreszenzfarbstoffe möglicherweise nicht die gleiche Empfindlichkeit wie radioaktive Sonden aufweisen, sind sie in der Lage, die Echtzeitaktivität von Molekülen in Aktion zu zeigen. Auch Bestrahlung und sachgerechte Handhabung sind nicht mehr zu befürchten.
Mit der Entwicklung der Fluoreszenzmarkierung hat die Fluoreszenzmikroskopie die Visualisierung spezifischer Proteine in fixierten und lebenden Zellenbildern ermöglicht. Die Lokalisierung spezifischer Proteine hat zu wichtigen Konzepten in der Zellbiologie geführt, wie den Funktionen verschiedener Proteingruppen in Zellmembranen und Organellen. Bei der Bildgebung von lebenden Zellen ermöglichen fluoreszierende Tags die Überwachung von Bewegungen von Proteinen und deren Interaktionen.
Neueste Fortschritte bei Methoden mit fluoreszierenden Tags haben zur Visualisierung von mRNA und ihrer Lokalisierung in verschiedenen Organismen geführt. Die Bildgebung von RNA in lebenden Zellen kann erreicht werden, indem synthetisierte RNA, die chemisch mit einem fluoreszierenden Tag gekoppelt ist, in lebende Zellen durch Mikroinjektion eingeführt wird. Diese Technik wurde verwendet , um zu zeigen , wie sich die oskar - mRNA im Drosophila - Embryo im hinteren Bereich der Eizelle lokalisiert .
Siehe auch
Anmerkungen
Externe Links
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