Transposase - Transposase

Transposase ist ein Enzym , das an das Ende eines Transposons bindet und seine Bewegung zu einem anderen Teil des Genoms durch einen Cut-and-Paste-Mechanismus oder einen replikativen Transpositionsmechanismus katalysiert . Das Wort "Transposase" wurde zuerst von den Individuen geprägt, die das für die Transposition des Tn3-Transposons erforderliche Enzym klonierten . Die Existenz von Transposons wurde in den späten 1940er Jahren von Barbara McClintock postuliert , die die Vererbung von Mais untersuchte , aber die tatsächliche molekulare Grundlage für die Transposition wurde von späteren Gruppen beschrieben. McClintock entdeckte, dass Teile der Chromosomen ihre Position änderten und von einem Chromosom zum anderen springen. Die Neupositionierung dieser Transposons (die für die Farbe kodierten) ermöglichte die Expression anderer Gene für Pigmente. Bei Mais führt die Transposition zu Farbveränderungen; in anderen Organismen, wie Bakterien, kann es jedoch zu Antibiotikaresistenzen führen. Die Umsetzung ist auch wichtig, um die genetische Vielfalt innerhalb der Arten und die Anpassungsfähigkeit an sich ändernde Lebensbedingungen zu schaffen. Im Laufe der menschlichen Evolution haben sich bis zu 40 % des menschlichen Genoms durch Methoden wie die Transposition von Transposons bewegt.

Transposasen sind unter der EG-Nummer EC 2.7.7 eingestuft.

Gene, die für Transposasen kodieren, sind in den Genomen der meisten Organismen weit verbreitet und die am häufigsten vorkommenden bekannten Gene.

Transposase Tn5

Transposase Tn5-Dimerisierungsdomäne
PDB 1mur EBI.jpg
tn5-Transposase: 20mer äußeres Ende 2 mn Komplex
Identifikatoren
Symbol Dimer_Tnp_Tn5
Pfam PF02281
InterPro IPR003201
SCOP2 1b7e / UMFANG / SUPFAM

Transposase (Tnp) Tn5 ist ein Mitglied der RNase- Superfamilie von Proteinen, die retrovirale Integrasen umfasst . Tn5 kommt in Shewanella- und Escherichia- Bakterien vor. Das Transposon kodiert für eine Antibiotikaresistenz gegenüber Kanamycin und anderen Aminoglykosid-Antibiotika.

Tn5 und andere Transposasen sind bemerkenswert inaktiv. Da DNA-Transpositionsereignisse von Natur aus mutagen sind, ist die geringe Aktivität von Transposasen notwendig, um das Risiko einer tödlichen Mutation im Wirt zu verringern und somit das transponierbare Element zu eliminieren . Einer der Gründe, warum Tn5 so unreaktiv ist, liegt darin, dass die N- und C-Termini relativ nahe beieinander liegen und dazu neigen, sich gegenseitig zu inhibieren. Dies wurde durch die Charakterisierung mehrerer Mutationen aufgeklärt, die zu hyperaktiven Formen von Transposasen führten. Eine solche Mutation, L372P, ist eine Mutation der Aminosäure 372 in der Tn5-Transposase. Diese Aminosäure ist im Allgemeinen ein Leucinrest in der Mitte einer Alpha-Helix. Wenn dieses Leucin durch einen Prolinrest ersetzt wird, wird die Alpha-Helix gebrochen, wodurch eine Konformationsänderung an der C-terminalen Domäne eingeführt wird, die sie ausreichend von der N-terminalen Domäne trennt, um eine höhere Aktivität des Proteins zu fördern. Die Transposition eines Transposons erfordert oft nur drei Teile: das Transposon, das Transposase-Enzym und die Ziel-DNA für die Insertion des Transposons. Dies ist bei Tn5 der Fall, das einen Ausschneide- und Einfügemechanismus verwendet, um Transposons zu bewegen.

Tn5 und die meisten anderen Transposasen enthalten ein DDE-Motiv, das das aktive Zentrum ist, das die Bewegung des Transposons katalysiert. Aspartat-97, Aspartat-188 und Glutamat-326 bilden das aktive Zentrum, das eine Triade von sauren Resten ist. Das DDE-Motiv soll zweiwertige Metallionen koordinieren, am häufigsten Magnesium und Mangan, die in der katalytischen Reaktion wichtig sind. Da Transposase unglaublich inaktiv ist, wird die DDE-Region mutiert, so dass die Transposase hyperaktiv wird und die Bewegung des Transposons katalysiert. Das Glutamat wird in ein Aspartat umgewandelt und die beiden Aspartate in Glutamate. Durch diese Mutation wird die Untersuchung von Tn5 möglich, jedoch gehen dadurch einige Schritte im katalytischen Prozess verloren.

1muh.jpg

Es gibt mehrere Schritte, die die Bewegung des Transposons katalysieren, einschließlich der Tnp-Bindung, der Synapse (der Bildung eines synaptischen Komplexes), der Spaltung, des Einfangens des Ziels und des Strangtransfers. Die Transposase bindet dann an den DNA-Strang und erzeugt eine Klammer über dem Transposonende der DNA und inseriert in das aktive Zentrum. Sobald die Transposase an das Transposon bindet, erzeugt sie einen synaptischen Komplex, in dem zwei Transposasen in einer cis/trans-Beziehung mit dem Transposon verbunden sind.

Bei der Spaltung aktivieren die Magnesiumionen Sauerstoff aus Wassermolekülen und setzen sie einem nukleophilen Angriff aus. Dadurch können die Wassermoleküle die 3'-Stränge an beiden Enden einschneiden und eine Haarnadelformation bilden, die das Transposon von der Donor-DNA trennt. Als nächstes bewegt die Transposase das Transposon an eine geeignete Stelle. Über die Zielerfassung ist nicht viel bekannt, obwohl ein Sequenzbias vorliegt, der noch nicht bestimmt wurde. Nach dem Einfangen des Ziels greift die Transposase die Ziel-DNA im Abstand von neun Basenpaaren an, was zur Integration des Transposons in die Ziel-DNA führt.

Wie bereits erwähnt, gehen aufgrund der Mutationen der DDE einige Verfahrensschritte verloren – zum Beispiel wenn dieses Experiment in vitro durchgeführt wird und die SDS-Wärmebehandlung die Transposase denaturiert. Es ist jedoch noch ungewiss, was mit der Transposase in vivo passiert .

Die Untersuchung der Transposase Tn5 ist wegen ihrer Ähnlichkeiten mit HIV- 1 und anderen retroviralen Erkrankungen von allgemeiner Bedeutung . Durch das Studium von Tn5 lässt sich auch viel über andere Transposasen und ihre Aktivitäten herausfinden.

Tn5 wird bei der Genomsequenzierung verwendet, indem das Tn5 verwendet wird, um Sequenzierungsadapter anzuhängen und die DNA in einer einzigen enzymatischen Reaktion zu fragmentieren, wodurch der Zeit- und Eingabeaufwand gegenüber der herkömmlichen Next Generation Sequencing Bibliotheksvorbereitung reduziert wird. Dieses Mittel der Bibliotheksvorbereitung wird auch in der Technik namens ATAC-seq verwendet .

Dornröschen-Transposase

Die Sleeping Beauty (SB) Transposase ist die Rekombinase, die das Sleeping Beauty Transposonsystem antreibt . Die SB-Transposase gehört zur DD[E/D]-Transposasenfamilie, die wiederum zu einer großen Superfamilie von Polynukleotidyltransferasen gehört, die RNase H, RuvC Holliday-Resolvase, RAG-Proteine ​​und retrovirale Integrasen umfasst. Das SB-System wird hauptsächlich bei Wirbeltieren zum Gentransfer, einschließlich Gentherapie, und Genforschung verwendet. Das konstruierte SB100X ist ein Enzym, das die hohe Transposon-Integration steuert.

Tn7 Transposon

Das Tn7-Transposon ist ein mobiles genetisches Element, das in vielen Prokaryonten wie Escherichia coli ( E. coli ) vorkommt und zuerst als DNA-Sequenz in bakteriellen Chromosomen und natürlich vorkommenden Plasmiden entdeckt wurde , die eine Resistenz gegen die Antibiotika Trimethoprim und Streptomycin kodieren . Speziell als transposables Element (Transposon) klassifiziert , kann die Sequenz durch die Verwendung eines selbstkodierten Rekombinase-Enzyms namens Transposase duplizieren und sich innerhalb eines Genoms bewegen, was zu Effekten wie der Erzeugung oder Umkehrung von Mutationen und der Veränderung der Genomgröße führt. Das Tn7-Transposon hat zwei Mechanismen entwickelt, um seine Ausbreitung unter Prokaryoten zu fördern. Wie viele andere bakterielle Transposons transponiert Tn7 mit niedriger Frequenz und inseriert an vielen verschiedenen Stellen mit geringer oder keiner Stellenselektivität. Durch diesen ersten Weg wird Tn7 bevorzugt in konjugierbare Plasmide geleitet , die repliziert und zwischen Bakterien verteilt werden können. Tn7 ist jedoch insofern einzigartig, als es auch mit hoher Frequenz an eine einzige spezifische Stelle in Bakterienchromosomen namens attTn7 transponiert. Diese spezifische Sequenz ist ein essentielles und hochkonserviertes Gen, das in vielen Bakterienstämmen vorkommt. Die Rekombination ist jedoch für das Wirtsbakterium nicht schädlich, da Tn7 tatsächlich stromabwärts des Gens transponiert, nachdem es erkannt wurde, was zu einem sicheren Weg führt, das Transposon zu vermehren, ohne den Wirt zu töten. Dieser hochentwickelte und ausgeklügelte Zielort-Selektionsweg legt nahe, dass dieser Weg sich entwickelt hat, um die Koexistenz zwischen dem Transposon und seinem Wirt sowie die erfolgreiche Übertragung von Tn7 in zukünftige Generationen von Bakterien zu fördern.

Das Tn7-Transposon ist 14 kb lang und kodiert für fünf Enzyme. Die Enden der DNA-Sequenz bestehen aus zwei Abschnitten, mit denen die Tn7-Transposase während der Rekombination interagiert. Das linke Segment (Tn7-L) ist 150 bp lang und die rechte Sequenz (Tn7-R) ist 90 bp lang. Beide Enden des Transposons enthalten eine Reihe von 22 bp-Bindungsstellen, die die Tn7-Transposase erkennt und an die sie bindet. Innerhalb des Transposons befinden sich fünf diskrete Gene, die für Proteine ​​kodieren, die die Transpositionsmaschinerie bilden. Darüber hinaus enthält das Transposon ein Integron , ein DNA-Segment, das mehrere Kassetten von Genen enthält, die für Antibiotikaresistenz kodieren.

Das Tn7-Transposon kodiert für fünf Proteine: TnsA, TnsB, TnsC, TnsD und TnsE. TnsA und TnsB interagieren zusammen, um das Tn7-Transposase-Enzym TnsAB zu bilden. Das Enzym erkennt und bindet spezifisch die Enden der DNA-Sequenz des Transposons und schneidet sie aus, indem es doppelsträngige DNA-Brüche an jedem Ende einführt. Die ausgeschnittene Sequenz wird dann an einer anderen Ziel-DNA-Stelle inseriert. Ähnlich wie bei anderen charakterisierten Transposons beinhaltet der Mechanismus für die Tn7-Transposition die Abspaltung der 3'-Enden von der spendenden DNA durch das TnsA-Protein der TnsAB-Transposase. Tn7 wird jedoch auch in der Nähe der 5'-Enden, etwa 5 bp vom 5'-Ende in Richtung des Tn7-Transposons, durch das TnsB-Protein von TnsAB einzigartig gespalten. Nach der Insertion des Transposons in die Ziel-DNA-Stelle sind die 3'-Enden kovalent an die Ziel-DNA gebunden, aber die 5 bp-Lücken sind noch an den 5'-Enden vorhanden. Als Ergebnis führt die Reparatur dieser Lücken zu einer weiteren 5-bp-Duplikation an der Zielstelle. Das TnsC-Protein interagiert mit dem Transposase-Enzym und der Ziel-DNA, um die Exzisions- und Insertionsprozesse zu fördern. Die Fähigkeit von TnsC, die Transposase zu aktivieren, hängt von seiner Wechselwirkung mit einer Ziel-DNA zusammen mit seinem geeigneten Zielprotein, TnsD oder TnsE, ab. Die TnsD und TnsE Proteine sind alternatives Ziel Selektoren, die auch die DNA - Bindung sind Aktivator , die das Ausschneiden und Einfügen von Tn7 fördern. Ihre Fähigkeit, mit einer bestimmten Ziel-DNA zu interagieren, ist der Schlüssel zur Zielort-Selektion von Tn7. Die Proteine ​​TnsA, TnsB und TnsC bilden somit die Kernmaschinerie von Tn7: TnsA und TnsB interagieren zusammen, um die Transposase zu bilden, während TnsC als Regulator der Transposase-Aktivität fungiert und zwischen der Transposase und TnsD und TnsE kommuniziert. Wenn das TnsE-Protein mit der TnsABC-Kernmaschinerie interagiert, steuert Tn7 bevorzugt Insertionen in konjugierbare Plasmide. Wenn das TnsD-Protein mit TnsABC interagiert, lenkt Tn7 bevorzugt Insertionen stromabwärts in eine einzelne essentielle und hochkonservierte Stelle im Bakterienchromosom. Diese Site, attTn7, wird speziell von TnsD erkannt.

Verweise

Externe Links