FLAG-Tag - FLAG-tag
FLAG-tag oder FLAG-Octapeptid oder FLAG-Epitop ist ein Polypeptid- Protein-Tag , das einem Protein unter Verwendung rekombinanter DNA- Technologie hinzugefügt werden kann , mit dem Sequenzmotiv DYKDDDDK (wobei D= Asparaginsäure , Y= Tyrosin und K= Lysin ) . Es ist eines der spezifischsten Tags und es ist ein künstliches Antigen, gegen das spezifische monoklonale Antikörper mit hoher Affinität entwickelt wurden, und kann daher zur Proteinreinigung durch Affinitätschromatographie verwendet werden und kann auch zum Lokalisieren von Proteinen in lebenden Zellen verwendet werden. Es wurde verwendet, um rekombinantes , überexprimiertes Protein von Wildtyp- Protein zu trennen , das vom Wirtsorganismus exprimiert wird. Es kann auch bei der Isolierung von Proteinkomplexen mit mehreren Untereinheiten verwendet werden, da sein mildes Reinigungsverfahren dazu neigt, solche Komplexe nicht zu zerstören. Es wurde verwendet, um Proteine von ausreichender Reinheit und Qualität zu erhalten, um eine 3D-Strukturbestimmung durch Röntgenkristallographie durchzuführen.
Ein FLAG-Tag kann in vielen verschiedenen Assays verwendet werden , die eine Erkennung durch einen Antikörper erfordern . Wenn kein Antikörper gegen ein bestimmtes Protein vorhanden ist, ermöglicht das Hinzufügen eines FLAG-Tags zu einem Protein die Untersuchung des Proteins mit einem Antikörper gegen die FLAG-Sequenz. Beispiele sind zelluläre Lokalisierungsstudien durch Immunfluoreszenz , Immunpräzipitation oder Nachweis durch SDS-PAGE- Proteinelektrophorese und Western-Blotting.
Die Peptidsequenz des FLAG-Tags vom N-Terminus zum C-Terminus ist: DYKDDDDK (1012 Da). Außerdem kann es im Tandem verwendet werden, üblicherweise das 3xFLAG-Peptid: DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK (wobei der letzte Tag eine Enterokinase-Spaltstelle codiert). Es kann an den C-Terminus oder den N-Terminus eines Proteins fusioniert oder in ein Protein eingefügt werden. Einige kommerziell erhältliche Antikörper (zB M1/4E11) erkennen das Epitop nur, wenn es am N-Terminus vorhanden ist. Andere verfügbare Antikörper (zB M2) sind jedoch positionsunempfindlich. Der Tyrosinrest im FLAG-Tag kann sulfatiert sein , was die Antikörpererkennung des FLAG-Epitops beeinträchtigen kann. Der FLAG-Tag kann in Verbindung mit anderen Affinitäts-Tags verwendet werden, beispielsweise einem Polyhistidin-Tag ( His-Tag ), HA-Tag oder myc-Tag .
Geschichte
Die erste Anwendung von Epitop-Tagging wurde 1984 von Munro und Pelham beschrieben. Das FLAG-Tag war das zweite Beispiel für ein voll funktionsfähiges, verbessertes Epitop-Tag, das in der wissenschaftlichen Literatur veröffentlicht wurde. und war der einzige Epitop-Tag, der patentiert wurde. Seitdem ist es der am häufigsten verwendete Protein-Tag in Labors weltweit. Im Gegensatz zu einigen anderen Tags (z. B. myc, HA), bei denen zunächst ein monoklonaler Antikörper gegen ein vorhandenes Protein isoliert, dann das Epitop charakterisiert und als Tag verwendet wurde, war das FLAG-Epitop ein idealisiertes, künstliches Design, gegen das monoklonale Antikörper gezüchtet wurden . Die Struktur des FLAG-Tags wurde hinsichtlich der Kompatibilität mit Proteinen, an die es angehängt ist, dahingehend optimiert, dass es hydrophiler ist als andere übliche Epitop-Tags und daher weniger wahrscheinlich Proteine, an die es angehängt ist, denaturiert oder inaktiviert. Darüber hinaus können N-terminale FLAG-Tags leicht von Proteinen entfernt werden, sobald sie isoliert wurden, durch Behandlung mit der spezifischen Protease, Enterokinase ( Enteropeptidase ).
Der dritte Bericht über Epitop-Tagging ( HA-tag ) erschien etwa ein Jahr nach der ersten Auslieferung des Flag-Systems.