Latrotoxin - Latrotoxin
Ein Latrotoxin ist ein hochmolekulares Neurotoxin, das im Gift von Spinnen der Gattung Latrodectus (Witwenspinnen) und auch im Gift der Spinnenart Steatoda nobilis vorkommt . Larotoxine sind die Hauptwirkstoffe des Giftes und für die Symptome des Latrodektismus verantwortlich .
Die folgenden Latrotoxine wurden beschrieben: fünf insektizide Toxine, die als α-, β-, -, δ- und -Latroinsektotoxine bezeichnet werden, ein wirbeltierspezifisches Neurotoxin , alpha-Latrotoxin, und ein Toxin, das Krebstiere betrifft , α-Latrocrustatoxin.
α-Latrotoxin
Das am besten untersuchte Latrotoxin ist Alpha-Latrotoxin, das präsynaptisch wirkt, um Neurotransmitter (einschließlich Acetylcholin ) aus sensorischen und motorischen Neuronen sowie auf endokrine Zellen ( um beispielsweise Insulin auszuschütten ) freizusetzen . Es ist ein ~130 kDa Protein , das hauptsächlich in seinen dimerisierten oder tetramerisierten Formen existiert.
α-Latrotoxin ( α-LTX ) kommt natürlicherweise in Witwenspinnen der Gattung Latrodectus vor . Die bekannteste dieser Spinnen sind die Schwarzen Witwen, Latrodectus mactans . Das Gift der Witwenspinnen ( Latrodectus ) enthält mehrere Proteintoxine, sogenannte Latrotoxine, die selektiv entweder gegen Wirbeltiere , Insekten oder Krebstiere abzielen . Eines dieser Toxine ist α-Latrotoxin und zielt selektiv gegen Wirbeltiere; es ist bei Insekten und Krebstieren unwirksam. α-LTX hat eine hohe Affinität für Rezeptoren, die für neuronale und endokrine Zellen von Wirbeltieren spezifisch sind.
Biosynthese
Wenn die DNA-Sequenz für α-LTX transkribiert und translatiert wird, wird ein inaktives Vorläufermolekül von α-LTX (156,9 kDa) gebildet. Dieses Vorläufermolekül durchläuft eine posttranslationale Prozessierung, bei der das letztendliche aktive α-LTX-Protein (131,5 kDa) gebildet wird.
Dem N-Terminus des α-LTX-Vorläufermoleküls gehen kurze hydrophile Sequenzen voraus, die mit einem Cluster basischer Aminosäuren enden. Diese Cluster werden von proteolytischen Enzymen (furinähnliche Proteasen ) erkannt , die durch Hydrolyse die α-LTX-Vorläufermoleküle spalten und aktivieren. Auch der C-Terminus wird von diesen furinähnlichen Proteasen erkannt und ebenfalls gespalten.
α-LTX-Vorläufermoleküle werden von freien Ribosomen im Zytosol synthetisiert und sind daher in den sekretorischen Epithelzellen der Giftdrüsen zytosolisch ., Sie können jedoch mit sekretorischen Granula assoziieren, obwohl sie nicht im Lumen der Granula aufgenommen werden. Das zytosolische α-LTX-Vorläufermolekül wird durch holokrine Sekretion aus der Zelle freigesetzt und gelangt dort in die Giftdrüse der Spinne. Diese Drüse enthält die verschiedenen Proteasen, die an der Spaltung des Vorläufer-α-LTX-Moleküls beteiligt sind.
Die Tertiärstruktur des α-LTX-Proteins lässt sich in drei Teile unterteilen: den N-terminalen Flügel (36 kDa), den Körper (76 kDa) und den C-terminalen Kopf (18,5 kDa). Aufgrund der C-terminalen Ankyrin-Repeats, die Protein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln, bildet das α-LTX-Monomer unter normalen Bedingungen ein Dimer mit einem anderen α-LTX-Monomer. Die Tetramerbildung aktiviert die Toxizität.
Toxikokinetik
α-LTX beeinflusst motorische Nervenendigungen und endokrine Zellen. Es sind keine größeren enzymatischen Aktivitäten verbunden. Stattdessen kann das Toxin Poren in den Lipidmembranen bilden und einen Ca 2+ -Ionenfluss induzieren . Der Wirkungseintritt durch Intoxikation kann mit einer Verzögerungszeit von 1 bis 10 Minuten erfolgen, selbst bei subnanomolaren Konzentrationen. Bei nanomolaren Konzentrationen treten Ausbrüche der Neurotransmitter-Freisetzung auf. Nach den Bursts treten verlängerte Perioden der Steady-State-Freisetzung in Kraft.
Die Stimulation von Aktionspotentialen der kleinen Endplatte wird anfänglich durch das Neurotoxin induziert, während später die Neurotransmission an der neuromuskulären Verbindung blockiert wird. Dies ist auf die Erschöpfung des synaptischen Vesikelinhalts zurückzuführen.
Toxikodynamik
α-LTX in seiner tetrameren Form interagiert mit Rezeptoren ( Neurexine und Latrophiline ) auf der neuronalen Membran, was die Insertion von α-LTX in die Membran bewirkt.
Sobald das Tetramer in die Zellmembran eingefügt ist, können zwei Wirkmechanismen auftreten. Erstens kann die Insertion zu Porenbildung und möglicherweise anderen Effekten führen, und zweitens kann der Rezeptor aktiviert werden, was zu einer intrazellulären Signalübertragung führt. Die vier Köpfe des Tetramers bilden eine Schale, die die Pore umgibt, die an einer Stelle auf 10 beschränkt ist. Millimolare Konzentrationen von Ca 2+ und Mg 2+ katalysieren stark die Tetramerbildung, was darauf hindeutet, dass der tetrametrische Zustand von zweiwertigen Kationen abhängig ist, während EDTA die Bildung des Dimers begünstigt. Die Forschung zeigt auch, dass Konzentrationen von La 3+ höher als 100 μM auch die Tetramerisierung blockieren. In reinen Lipidmembranen kann eine Porenbildung auftreten, aber rekonstituierte Rezeptoren erhöhen die Porenbildung stark. Biologische Membranen blockieren die Porenbildung, wenn keine α-LTX-Rezeptoren vorhanden sind (Neurexin, Latrophilin, PTPσ). Es ist auch bekannt, dass die drei hochkonservierten Cysteinreste an der α-LTX-Rezeptorbindung beteiligt sind, da Mutanten, die Serin anstelle von Cysteinresten enthielten, keine Toxizität induzierten. Die N-terminale Domäne muss sich richtig falten, in der die Disulfidbindungen funktionsfähig sein müssen. Das α-LTX-Toxin wird von einem kleinen Protein, LMWP oder Latrodectin, gebunden. Es wurde beobachtet, dass die Porenbildung in Lipiddoppelschichten unmöglich ist, wenn Latrodectin nicht verfügbar ist. Lactrodectin hat keinen Einfluss auf die α-LTX-Toxizität.
Porenbildung
Die von α-LTX gebildeten Poren in der Membran sind für Ca 2+ durchlässig und ermöglichen daher einen Einstrom von Ca 2+ in die Zelle. Dieser Einstrom in eine erregbare Zelle stimuliert die Exozytose direkt und effizient. Der Kationeneinstrom ist proportional zur Menge der Poren und damit der Menge der beteiligten Rezeptoren, die auf der Zellmembran exprimiert werden. Auch Ca 2+ erleichtert stark die Bildung der Tetramere und damit deren Porenbildung. Die Pore ist auch für Neurotransmitter durchlässig, was zu einem massiven Austreten des Neurotransmitterpools im Zytosol führt .
Neben dem Einströmen von Ca 2+ ist der Kanal nicht sehr selektiv, sodass auch Na + , K + , Ba 2+ , Sr 2+ , Mg 2+ , Li + und Cs + die Membran passieren können. Die Pore ist die meiste Zeit offen, mit einer Öffnungswahrscheinlichkeit von 0,8. Die meisten dreiwertigen Kationen blockieren Kanäle bei 50–100 μM, wie Yb 3+ , Gd 3+ , Y 3+ , La 3+ und Al 3+ .
Die Pore ist nicht nur für Kationen durchlässig, sondern auch für Wasser. Dies führt zu einer Schwellung der Nervenenden. Weitere Störungen des Membranpotentials treten aufgrund der Permeabilität kleiner Moleküle wie Neurotransmitter und ATP auf, die α-LTX-Poren zu passieren.
- Membranpenetration
Obwohl die Bildung von tetrameren Poren von α-Latrotoxin schlüssig gezeigt wurde, bestreiten einige Autoren immer noch, ob dies der Hauptwirkungsmechanismus von α-Latrotoxin ist, und glauben, dass α-Latrotoxin (tetramer oder nicht) durch die Membran von Zielzellen eindringen kann, um interagieren direkt mit der intrazellulären Neurotransmitter-Freisetzungsmaschinerie.
Rezeptoren
Der folgende Mechanismus wird für rezeptorvermittelte Wirkungen vorgeschlagen. Drei Rezeptoren für α-Latrotoxin wurden beschrieben:
- neurexin
- Latrophilin (auch bekannt als CIRL, Calcium-unabhängiger Rezeptor für Latrophilin)
- Protein-Tyrosin-Phosphatase-Sigma (PTPσ).
Das Toxin stimuliert einen Rezeptor, höchstwahrscheinlich Latrophilin, bei dem es sich um einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor handelt, der mit Gαq/11 verbunden ist. Der nachgeschaltete Effektor von Gαq/11 ist Phospholipase C (PLC). Bei aktivierter PLC erhöht sich die zytosolische Konzentration von IP3, was wiederum die Freisetzung von Ca 2+ aus intrazellulären Speichern induziert . Dieser Anstieg des zytosolischen Ca 2+ kann die Freisetzungswahrscheinlichkeit und die Rate der spontanen Exozytose erhöhen. Latrophilin mit α-LTX kann die Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) induzieren. PKC ist für die Phosphorylierung von SNARE-Proteinen verantwortlich. Somit induziert Latrophilin mit α-LTX die Wirkung der Exozytose von Transportvesikeln. Der genaue Mechanismus muss entdeckt werden.
- Signalisierung
Neben den Haupteffekten der Porenbildung von α-Latrotoxin werden andere Effekte von α-Latrotoxin durch Interaktion mit Latrophilin und intrazelluläre Signalübertragung vermittelt (siehe Signaltransduktion ).
Strukturaktivitätsbeziehung (SAR)
Das natürlich vorkommende α-LTX-Dimer muss ein Tetramer bilden, um toxisch zu sein. Tetramerisierung tritt nur in Gegenwart von zweiwertigen Kationen (wie Ca 2+ oder Mg 2+ ) oder amphipathischen Molekülen auf. Die vier Monomere, die dieses Tetramer bilden, sind symmetrisch um eine zentrale Achse angeordnet, ähnlich einem vierblättrigen Propeller mit einem Durchmesser von 250 und einer Dicke von 100 . Die Kopfdomänen bilden die kompakte, zentrale Masse, die von den Körperdomänen zusammengeführt und umgeben ist. Die Flügel stehen senkrecht zur Achse des Tetramers. Aufgrund dieser Form enthält das Tetramer einen birnenförmigen Kanal in der Zentralmasse. Am unteren Ende beträgt der Durchmesser dieses Kanals 25 , erweitert sich dann auf 36 und verengt sich oben auf 10 .
Die Basis des Tetramers (unter den Flügeln) ist 45 tief und hydrophob, was die Insertion in die Zellmembran vermittelt. Auch die Insertion des Tetramers ist nur in Gegenwart bestimmter Rezeptoren (hauptsächlich Neurexin Iα und Latrophilin und in geringem Maße PTPσ) auf der Membran möglich. Neurexin Iα vermittelt nur die Insertion in Gegenwart von Ca 2+ , während Latrophilin und PTPσ die Insertion ohne Gegenwart von Ca 2+ vermitteln können . Durch den Kanal und die Einfügung in die Zellmembran macht das Protein die Zelle also durchlässiger für Stoffe, die den Kanal passieren können. Diese Substanzen sind mono- und bivalente Kationen, Neurotransmitter, Fluoreszenzfarbstoffe und ATP.
Toxizität
Die LD50 von α-LTX beträgt bei Mäusen 20–40 µg/kg KG.
Die LD50 von Latrodectus- Gift in mg/kg für verschiedene Arten: Frosch = 145, Amsel = 5,9, Kanarienvogel = 4,7, Schabe = 2,7, Küken = 2,1, Maus = 0,9, Stubenfliege = 0,6, Taube = 0,4, Meerschweinchen = 0,1 .
Wissenschaftlicher Beitrag
αLTX hat dazu beigetragen, die vesikuläre Transporthypothese der Transmitterfreisetzung zu bestätigen, den Bedarf an Ca 2+ für die vesikuläre Exozytose zu ermitteln und einzelne Transmitterfreisetzungsstellen im Zentralnervensystem zu charakterisieren. Es half, zwei Familien wichtiger neuronaler Zelloberflächenrezeptoren zu identifizieren.
Die mutierte Form von αLTX, die αLTXN4C genannt wird und keine Poren bildet, hat zur Forschung beigetragen. Es unterstützte den Ansatz, den durch αLTX stimulierten intrazellulären Signalübertragungsmechanismus zu entschlüsseln. Das mutierte Toxin kann auch verwendet werden, um die Natur und Eigenschaften von intrazellulären Ca 2+ -Speichern zu untersuchen, die am Toxinrezeptor-Transduktionsweg beteiligt sind, und deren Wirkung auf evozierte postsynaptische Potentiale. Das mutierte Toxin kann auch ein Instrument sein, um die endogenen Funktionen von &agr;LTX aufzuklären.
Andere Giftkomponenten
Die natürliche Beute von Witwenspinnen sind Insekten, und in ihrem Gift finden sich mehrere Insektotoxine. Die Latroinsektotoxine scheinen ähnliche Strukturen zu haben.
Zu den hochmolekularen Proteinen, die aus der Mittelmeer-Schwarzen Witwe ( L. tredecimguttatus ) isoliert wurden, gehören die insektenspezifischen Neurotoxine α-Latroinsectotoxin und δ-Latroinsectotoxin, ein Neurotoxin, das Krebstiere befällt, bekannt als Latrocrustatoxin, und kleine Peptide , die Angiotensin-1 -umwandelndes Enzym .
Abgesehen von den oben beschriebenen hochmolekularen Latrotoxinen enthält das Gift von Latrodectus auch Proteine mit niedrigem Molekulargewicht, deren Funktion noch nicht vollständig erforscht wurde, aber möglicherweise an der Erleichterung der Membraninsertion von Latrotoxinen beteiligt ist.