Antwort - Replisome

Das Replisom ist eine komplexe molekulare Maschine , die die Replikation der DNA durchführt . Das Replisom entwindet zunächst doppelsträngige DNA in zwei Einzelstränge. Für jeden der resultierenden Einzelstränge wird eine neue komplementäre DNA-Sequenz synthetisiert. Das Nettoergebnis ist die Bildung von zwei neuen doppelsträngigen DNA-Sequenzen, die exakte Kopien der ursprünglichen doppelsträngigen DNA-Sequenz sind.

Strukturell besteht das Replisom aus zwei replikativen Polymerasekomplexen , von denen einer den Leitstrang synthetisiert , während der andere den Nachlaufstrang synthetisiert . Das Replisom besteht aus einer Reihe von Proteinen, einschließlich Helikase , RFC , PCNA , Gyrase / Topoisomerase , SSB / RPA , Primase , DNA-Polymerase III , RNAse H und Ligase .

Überblick über den prokaryotischen DNA-Replikationsprozess

Bei Prokaryoten erfordert jedes sich teilende Nukleoid (Region, die genetisches Material enthält, das kein Kern ist) zwei Replisomen für die bidirektionale Replikation . Die beiden Replisomen setzen die Replikation an beiden Gabeln in der Mitte der Zelle fort. Schließlich trennen sich die beiden Replisomen bei der Replikation der Terminationsstelle von der DNA. Das Replisom verbleibt an einem festen Ort in der Mitte der Zelle in der Zelle, an der Membran befestigt , und die DNA-Matrize durchzieht es. Die DNA wird durch das stationäre Replisomenpaar, das sich an der Zellmembran befindet, zugeführt.

Überblick über den eukaryotischen DNA-Replikationsprozess

Bei Eukaryoten bilden sich zahlreiche Replikationsblasen an den Replikationsursprüngen im gesamten Chromosom . Wie bei Prokaryoten sind zwei Replisomen erforderlich, eines an jeder Replikationsgabel, die sich am Ende der Replikationsblase befindet. Aufgrund signifikanter Unterschiede in der Chromosomengröße und der damit verbundenen Komplexität hochkondensierter Chromosomen sind verschiedene Aspekte des DNA-Replikationsprozesses in Eukaryoten, einschließlich der terminalen Phasen, weniger gut charakterisiert als bei Prokaryoten.

Herausforderungen der DNA-Replikation

Das Replisom ist ein System, in dem verschiedene Faktoren zusammenwirken, um die strukturellen und chemischen Herausforderungen der DNA-Replikation zu lösen. Die Größe und Struktur der Chromosomen variiert zwischen den Organismen, aber da DNA-Moleküle das Reservoir der genetischen Information für alle Lebensformen sind, sind viele Replikationsherausforderungen und -lösungen für verschiedene Organismen gleich. Als Ergebnis sind die Replikationsfaktoren, die diese Probleme lösen, in Bezug auf Struktur, Chemie, Funktionalität oder Sequenz hochgradig konserviert. Zu den allgemeinen strukturellen und chemischen Herausforderungen gehören:

• Effiziente Replisom-Assemblierung an Replikationsursprüngen (Ursprungserkennungskomplexe oder spezifische Replikationsursprungssequenzen in einigen Organismen)
• Trennung des Duplex in die führenden und nacheilenden Templatstränge ( Helikasen )
• Schutz der vor- und nacheilenden Litzen vor Beschädigung nach Duplextrennung (SSB- und RPA-Faktoren)
• Priming der führenden und nacheilenden Template-Stränge (Primase oder DNA-Polymerase alpha)
• Sicherstellung der Prozessivität (Clamp-Ladefaktoren, ringförmige Clamp-Proteine, strangbindende Proteine)
• High-Fidelity-DNA-Replikation (DNA-Polymerase III, DNA-Polymerase Delta, DNA-Polymerase Epsilon. Alle haben aufgrund ihrer Struktur und Chemie intrinsisch niedrige Fehlerraten.)
• Fehlerkorrektur (Erkennungsfehler der aktiven Zentren der Replikativen Polymerase ; 3' bis 5'- Exonukleasedomänen von replikativen Polymerasen beheben Fehler)
• Synchronisierte Polymerisation von Leading- und Laging-Strängen trotz antiparalleler Struktur (Replikationsgabelstruktur, Dimerisierung von replikativen Polymerasen)
• Primerentfernung (DNA-Polymerase I, RNAse H, Flap- Endonukleasen wie FEN1 oder andere DNA-Reparaturfaktoren)
• Bildung von Phosphodiesterbindungen an Lücken zwischen Okazaki-Fragmenten (Ligase)

Im Allgemeinen betreffen die Herausforderungen der DNA-Replikation die Struktur der Moleküle, die Chemie der Moleküle und aus systemischer Sicht die zugrunde liegenden Beziehungen zwischen Struktur und Chemie.

Die Herausforderungen der DNA-Replikation lösen

Viele der strukturellen und chemischen Probleme, die mit der DNA-Replikation verbunden sind, werden durch molekulare Maschinen bewältigt, die in allen Organismen hochgradig konserviert sind. In diesem Abschnitt wird erörtert, wie Replisomenfaktoren die strukturellen und chemischen Herausforderungen der DNA-Replikation lösen.

Antwortmontage

Die DNA-Replikation beginnt an Stellen, die als Replikationsursprünge bezeichnet werden. In Organismen mit kleinen Genomen und einfacher Chromosomenstruktur, wie z. B. Bakterien, kann es auf jedem Chromosom nur wenige Replikationsursprünge geben. Organismen mit großen Genomen und komplexer Chromosomenstruktur, wie der Mensch, können Hunderte oder sogar Tausende von Replikationsursprüngen haben, die über mehrere Chromosomen verteilt sind.

Die DNA-Struktur variiert mit Zeit, Raum und Sequenz, und es wird angenommen, dass diese Variationen zusätzlich zu ihrer Rolle bei der Genexpression auch eine aktive Rolle beim Zusammenbau von Replisomen während der DNA-Synthese spielen. Die Replisom-Assemblierung an einem Replikationsursprung wird grob in drei Phasen unterteilt.

Für Prokaryoten:

• Bildung eines Prä-Replikationskomplexes. DNA bindet an den Ursprungserkennungskomplex und trennt den Duplex. Dies zieht DnaB-Helikase und DnaC an , die die Replikationsblase aufrechterhalten.
• Bildung des Präinitiationskomplexes. SSB bindet an den Einzelstrang und dann bindet Gamma (Clamp Loading Factor) an SSB.
• Bildung des Initiationskomplexes. Gamma lagert die Gleitklemme (beta) ab und zieht DNA-Polymerase III an.

Für Eukaryoten:

• Bildung eines Prä-Replikationskomplexes. MCM- Faktoren binden an den Ursprungserkennungskomplex und trennen den Duplex, wodurch eine Replikationsblase gebildet wird.
• Bildung des Präinitiationskomplexes. Replikationsprotein A (RPA) bindet an die einzelsträngige DNA und dann bindet RFC (Clamp Loading Factor) an RPA.
• Bildung des Initiationskomplexes. RFC lagert die Gleitklemme ( PCNA ) ab und zieht DNA-Polymerasen wie Alpha (α), Delta (δ), Epsilon (ε) an.

Sowohl bei Prokaryoten als auch bei Eukaryoten wird die nächste Stufe im Allgemeinen als „Elongation“ bezeichnet, und während dieser Phase findet der Großteil der DNA-Synthese statt.

Duplex trennen

DNA ist ein Duplex, der aus zwei antiparallelen Strängen gebildet wird. Nach Meselson-Stahl ist der Prozess der DNA-Replikation semikonservativ, wobei während der Replikation der ursprüngliche DNA-Duplex in zwei Tochterstränge (als Leading- und Lagging-Strang-Template bezeichnet) aufgetrennt wird. Jeder Tochterstrang wird Teil eines neuen DNA-Duplex. Faktoren, die allgemein als Helikasen bezeichnet werden, wickeln den Duplex ab.

Helicasen

Helicase ist ein Enzym, das Wasserstoffbrücken zwischen den Basenpaaren in der Mitte des DNA-Duplex bricht. Seine Donut-ähnliche Struktur wickelt sich um die DNA und trennt die Stränge vor der DNA-Synthese. In Eukaryoten wirkt der Mcm2-7-Komplex als Helikase, wobei jedoch nicht ganz klar ist, welche Untereinheiten für die Helikase-Aktivität erforderlich sind. Diese Helikase transloziert in die gleiche Richtung wie die DNA-Polymerase (3' nach 5' bezüglich des Matrizenstrangs). In prokaryotischen Organismen sind die Helikasen besser identifiziert und umfassen dnaB , das sich 5' nach 3' auf dem Strang gegenüber der DNA-Polymerase bewegt.

Abwickeln von Superspulen und Dekatenation

Wenn die Helikase die Doppelhelix abwickelt, führen topologische Veränderungen, die durch die Rotationsbewegung der Helikase induziert werden, zu einer Supercoil-Bildung vor der Helikase (ähnlich dem, was passiert, wenn man ein Stück Faden verdreht).

Gyrase und Topoisomerasen

Gyrase (eine Form der Topoisomerase ) entspannt und macht das durch Helikase verursachte Supercoiling rückgängig. Es tut dies, indem es die DNA-Stränge schneidet, ihm erlaubt, sich zu drehen und die Superspule freizugeben, und dann die Stränge wieder zusammenfügt. Gyrase wird am häufigsten stromaufwärts der Replikationsgabel gefunden, wo sich die Supercoils bilden.

Schutz der vor- und nacheilenden Stränge

Einzelsträngige DNA ist sehr instabil und kann mit sich selbst Wasserstoffbrückenbindungen bilden, die als „Haarnadeln“ bezeichnet werden (oder der Einzelstrang kann sich nicht ordnungsgemäß an den anderen Einzelstrang binden). Um dieser Instabilität entgegenzuwirken, binden einzelsträngige Bindungsproteine (SSB in Prokaryoten und Replikationsprotein A in Eukaryoten) an die exponierten Basen, um eine falsche Ligation zu verhindern.

Wenn Sie jeden Strang als "dynamischen, dehnbaren String" betrachten, sollte das strukturelle Potenzial für eine unsachgemäße Ligation offensichtlich sein.

Der nacheilende Strang ohne Bindungsproteine.
TAGCTATATATACGTCGATCTTCGAATTTATATACGATCGTAC Nacheilende Litzenbasen =========================================== Zucker-Phosphat-Rückgrat

Ein erweitertes Schema zeigt die zugrunde liegende Chemie des Problems: das Potenzial für die Bildung von Wasserstoffbrücken zwischen nicht verwandten Basenpaaren.

Schematische Ansicht neu getrennter DNA-Stränge ohne strangbindende Proteine.
--HH--------HH-HH--H--HH----------HH--HH--H Schema der Wasserstoffbrückenbindung HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH Schema der Wasserstoffbrückenbindung HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH Schema der Wasserstoffbrückenbindung TAGCTATATATACGTCGATCTTCGAATTTATATACGATCGTAC Nacheilende Litzenbasen =========================================== Zucker-Phosphat-Rückgrat

Bindeproteine ​​stabilisieren den Einzelstrang und schützen den Strang vor Schäden durch nicht lizenzierte chemische Reaktionen.

Der nacheilende Strang ist mit Bindungsproteinen (*) beschichtet, die eine falsche Ligation verhindern.
******************************************* Strangbindende Proteine TAGCTATATATACGTCGATCTTCGAATTTATATACGATCGTAC Nacheilende Litzenbasen =========================================== Zucker-Phosphat-Rückgrat

Die Kombination eines Einzelstrangs und seiner Bindungsproteine ​​dient als besseres Substrat für replikative Polymerasen als ein nackter Einzelstrang (Bindungsproteine ​​liefern eine zusätzliche thermodynamische Triebkraft für die Polymerisationsreaktion). Strangbindende Proteine ​​werden durch replikative Polymerasen entfernt.

Vorbereiten der führenden und nacheilenden Stränge

Sowohl aus struktureller als auch aus chemischer Sicht ist ein DNA-Einzelstrang allein (und die zugehörigen einzelsträngigen Bindungsproteine) nicht für die Polymerisation geeignet. Dies liegt daran, dass die von replikativen Polymerasen katalysierten chemischen Reaktionen ein freies 3'-OH erfordern, um die Nukleotidkettenverlängerung zu initiieren. In Bezug auf die Struktur bedeutet die Konformation der aktiven Zentren der replikativen Polymerase (die stark mit der inhärenten Genauigkeit von replikativen Polymerasen zusammenhängt), dass diese Faktoren die Kettenverlängerung ohne eine bereits vorhandene Kette von Nukleotiden nicht starten können, da keine bekannte replikative Polymerase die Kettenverlängerung starten kann de novo.

Priming-Enzyme (bei denen es sich um DNA-abhängige RNA-Polymerasen handelt ) lösen dieses Problem, indem sie einen RNA-Primer auf den führenden und nacheilenden Strängen erzeugen. Der führende Strang wird einmal geprimt, und der nachlaufende Strang wird ungefähr alle 1000 (+/- 200) Basenpaare geprimt (ein Primer für jedes Okazaki-Fragment auf dem nachlaufenden Strang). Jeder RNA-Primer ist ungefähr 10 Basen lang.

DNA-Einzelstrang mit strangbindenden Proteinen (*) und RNA-Primer, hinzugefügt durch Priming-Enzyme (UAGCUAUAUAUA).
=========================================== Zucker-Phosphat-Rückgrat ATCGATATATATGCAGCTAGAAGCTTAAATATATGCTAGCATG Nacheilende Litzenbasen UAGCUAUAUAUA******************************* RNA-Primer und strangbindende Proteine

Die Grenzfläche bei (A*) enthält ein freies 3'-OH, das chemisch für die durch replikative Polymerasen katalysierte Reaktion geeignet ist, und die "Überhang"-Konfiguration ist strukturell für die Kettenverlängerung durch eine replikative Polymerase geeignet. Somit können replikative Polymerasen die Kettenverlängerung bei (A*) beginnen.

Primas

Bei Prokaryoten erzeugt die Primase einen RNA-Primer am Anfang der neu getrennten führenden und nacheilenden Stränge.

DNA-Polymerase alpha

In Eukaryoten erzeugt DNA-Polymerase alpha einen RNA-Primer am Anfang der neu getrennten führenden und nacheilenden Stränge, und im Gegensatz zu Primase synthetisiert DNA-Polymerase alpha auch eine kurze Kette von Desoxynukleotiden, nachdem der Primer erzeugt wurde.

Sicherstellung von Prozessivität und Synchronisation

Prozessivität bezieht sich sowohl auf die Geschwindigkeit als auch auf die Kontinuität der DNA-Replikation, und eine hohe Prozessivität ist eine Voraussetzung für eine rechtzeitige Replikation. Eine hohe Prozessivität wird teilweise durch ringförmige Proteine ​​gewährleistet, die als „Klammern“ bezeichnet werden und den replikativen Polymerasen helfen, mit den führenden und nacheilenden Strängen verbunden zu bleiben. Es gibt noch andere Variablen: Aus chemischer Sicht stimulieren strangbindende Proteine ​​die Polymerisation und liefern zusätzliche thermodynamische Energie für die Reaktion. Aus der Systemperspektive sind die Struktur und Chemie vieler Replisomfaktoren (wie die AAA+ ATPase-Merkmale der einzelnen Klammerladungsuntereinheiten zusammen mit der von ihnen angenommenen helikalen Konformation) und die Assoziationen zwischen Klammerladungsfaktoren und anderen akzessorischen Faktoren, erhöht auch die Prozessivität.

Bis zu diesem Punkt sind laut Forschungen von Kuriyan et al. aufgrund ihrer Rolle bei der Rekrutierung und Bindung anderer Faktoren wie Priming-Enzymen und replikativen Polymerasen Klammerlader und Gleitklammern das Herzstück der Replisomenmaschinerie. Die Forschung hat ergeben, dass die Faktoren für die Klemmbelastung und die Gleitklemmenfaktoren für die Replikation absolut unerlässlich sind, was den hohen Grad an struktureller Erhaltung erklärt, der für die Klemmlast- und Gleitklemmenfaktoren beobachtet wird. Diese architektonische und strukturelle Erhaltung wird bei so unterschiedlichen Organismen wie Bakterien, Phagen, Hefen und Menschen beobachtet. Dass ein derart signifikanter Grad an struktureller Konservierung ohne Sequenzhomologie beobachtet wird, unterstreicht die Bedeutung dieser strukturellen Lösungen für Replikationsherausforderungen weiter.

Klammerlader

Clamp Loader ist ein allgemeiner Begriff, der sich auf Replikationsfaktoren bezieht, die als Gamma (Prokaryoten) oder RFC (Eukaryoten) bezeichnet werden. Die Kombination von Matrizen-DNA und Primer-RNA wird als " A-Form-DNA " bezeichnet und es wird angenommen, dass Clamp-Loading-Replikationsproteine ​​(helikale Heteropentamere) aufgrund ihrer Form (der Struktur der Haupt- / kleine Furche) und Chemie (Muster von Wasserstoffbrücken- Donoren und -Akzeptoren). Somit assoziieren Clamp-ladende Proteine ​​mit der geprimten Region des Strangs, was eine Hydrolyse von ATP bewirkt und Energie liefert, um die Clamp zu öffnen und an den Strang zu binden.

Schiebeklemme

Gleitklemme ist ein Oberbegriff, der sich auf ringförmige Replikationsfaktoren bezieht, die Beta (Prokaryoten) oder PCNA (Eukaryoten) genannt werden. Klemmproteine ​​ziehen replikative Polymerasen wie DNA-Polymerase III an und binden sie an, um die Zeitdauer zu verlängern, in der eine replikative Polymerase mit dem Strang assoziiert bleibt. Aus chemischer Sicht hat die Klammer in ihrem Zentrum eine leicht positive Ladung, die nahezu perfekt mit der leicht negativen Ladung des DNA-Strangs übereinstimmt.

Bei einigen Organismen ist die Klammer ein Dimer und bei anderen Organismen ist die Klammer ein Trimer. Unabhängig davon ermöglicht die konservierte Ringarchitektur, dass die Klemme den Strang umschließt.

Dimerisierung von replikativen Polymerasen

Replikative Polymerasen bilden an der Replikationsgabel ein asymmetrisches Dimer, indem sie an Untereinheiten des Clamp-Ladefaktors binden. Diese asymmetrische Konformation ist in der Lage, gleichzeitig die führenden und nacheilenden Stränge zu replizieren, und die Sammlung von Faktoren, die die replikativen Polymerasen umfasst, wird im Allgemeinen als Holoenzym bezeichnet . Es bleiben jedoch erhebliche Herausforderungen: Die führenden und die nacheilenden Stränge sind antiparallel. Dies bedeutet, dass die Nukleotidsynthese am Leitstrang natürlicherweise in 5'- nach 3'-Richtung stattfindet. Der nachlaufende Strang verläuft jedoch in die entgegengesetzte Richtung, und dies stellt eine ziemliche Herausforderung dar, da keine bekannten replikativen Polymerasen DNA in 3'- bis 5'-Richtung synthetisieren können.

Die Dimerisierung der replikativen Polymerasen löst die Probleme im Zusammenhang mit einer effizienten Synchronisation der Synthese von führenden und nacheilenden Strängen an der Replikationsgabel, aber die enge räumlich-strukturelle Kopplung der replikativen Polymerasen schafft bei der Lösung des schwierigen Problems der Synchronisation eine weitere Herausforderung: die Dimerisierung von die replikativen Polymerasen an der Replikationsgabel bedeutet, dass die Nukleotidsynthese für beide Stränge an der gleichen räumlichen Stelle stattfinden muss, obwohl der nacheilende Strang relativ zum führenden Strang rückwärts synthetisiert werden muss. Die Synthese des Nachlaufstrangs findet statt, nachdem die Helikase eine ausreichende Menge des Nachlaufstrangs abgewickelt hat, und diese "ausreichende Menge des Nachlaufstrangs" wird in diskreten Nukleotidketten, den Okazaki-Fragmenten, polymerisiert.

Beachten Sie Folgendes: Die Helikase wickelt den Elternduplex kontinuierlich ab, aber der nacheilende Strang muss in die entgegengesetzte Richtung polymerisiert werden. Dies bedeutet, dass während die Polymerisation des voreilenden Strangs fortschreitet, die Polymerisation des nacheilenden Strangs erst erfolgt, nachdem genügend des nacheilenden Strangs von der Helikase abgewickelt wurde. An diesem Punkt assoziiert die replikative Polymerase des nacheilenden Strangs mit der Klammer und dem Primer, um die Polymerisation zu starten. Während der Synthese des nacheilenden Strangs schickt die replikative Polymerase den nacheilenden Strang zurück zur Replikationsgabel. Die replikative Polymerase dissoziiert, wenn sie einen RNA-Primer erreicht. Helicase fährt fort, den parentalen Duplex abzuwickeln, das Priming-Enzym fixiert einen anderen Primer und die replikative Polymerase assoziiert sich wieder mit der Klammer und dem Primer, wenn eine ausreichende Menge des nacheilenden Strangs abgewickelt wurde.

Zusammenfassend wird die Synthese von führenden und nacheilenden Strängen als "semidiskontinuierlich" bezeichnet.

High-Fidelity-DNA-Replikation

Prokaryontische und eukaryontische Organismen verwenden eine Vielzahl von replikativen Polymerasen, von denen einige gut charakterisiert sind:

• DNA-Polymerase III
• DNA-Polymerase delta
• DNA-Polymerase Epsilon

DNA-Polymerase III

Diese Polymerase synthetisiert führende und nachlaufende DNA in Prokaryonten.

DNA-Polymerase delta

Diese Polymerase synthetisiert nacheilende Strang-DNA in Eukaryoten. (Vermutlich ein asymmetrisches Dimer mit DNA-Polymerase Epsilon zu bilden.)

DNA-Polymerase Epsilon

Diese Polymerase synthetisiert Leitstrang-DNA in Eukaryoten. (Vermutlich ein asymmetrisches Dimer mit DNA-Polymerase-Delta zu bilden.)

Korrekturlesen und Fehlerkorrektur

Obwohl selten, kommt es während der Kettenverlängerung zu einer falschen Basenpaarungspolymerisation. (Aufgrund der Struktur und Chemie von replikativen Polymerasen sind Fehler unwahrscheinlich, aber sie treten auf.) Viele replikative Polymerasen enthalten einen "Fehlerkorrektur"-Mechanismus in Form einer 3' bis 5'-Exonukleasedomäne, die in der Lage ist, Basenpaare aus . zu entfernen das exponierte 3'-Ende der wachsenden Kette. Eine Fehlerkorrektur ist möglich, da Basenpaarfehler die Position der Magnesiumionen in der Polymerisationsuntereinheit verzerren und die strukturchemische Verzerrung der Polymerisationseinheit den Polymerisationsprozess durch Verlangsamung der Reaktion effektiv zum Stillstand bringt. Anschließend übernimmt die chemische Reaktion in der Exonuklease-Einheit und entfernt Nukleotide vom exponierten 3'-Ende der wachsenden Kette. Sobald ein Fehler behoben ist, kehrt die Struktur und Chemie der Polymerisationseinheit zum Normalzustand zurück und die DNA-Replikation wird fortgesetzt. Auf diese Weise kollektiv arbeitend, kann man sich das aktive Zentrum der Polymerisation als "Korrektur-Lesegerät" vorstellen, da es Fehlpaarungen erkennt, und die Exonuklease ist der "Herausgeber", da sie die Fehler korrigiert.

Basenpaarfehler verzerren das aktive Zentrum der Polymerase für 4-6 Nukleotide, was bedeutet, dass es je nach Art der Fehlpaarung bis zu sechs Chancen für eine Fehlerkorrektur gibt. Die Fehlererkennungs- und Fehlerkorrekturfunktionen tragen zusammen mit der inhärenten Genauigkeit, die sich aus der Struktur und Chemie von replikativen Polymerasen ergibt, zu einer Fehlerrate von ungefähr 1 Basenpaar-Fehlpaarung in 10 ⁸ bis 10 ¹⁰ Basenpaaren bei.

Schematische Darstellung der korrekten Basenpaare, gefolgt von 8 möglichen Basenpaar-Fehlpaarungen.
=========================================== Zucker-Phosphat-Rückgrat ATCG AGAC TTCG xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx Original-Lagerstrang-Basen TAGC AGGC TCAT xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx Korrekt übereinstimmende Basen, gefolgt von 8 möglichen Fehlpaarungen =========================================== Zucker-Phosphat-Rückgrat

Fehler können in drei Kategorien eingeteilt werden: Purin-Purin-Fehlpaarungen, Pyrimidin-Pyrimidin-Fehlpaarungen und Pyrimidin-Purin-Fehlpaarungen. Die Chemie jeder Fehlpaarung variiert, ebenso wie das Verhalten der replikativen Polymerase in Bezug auf ihre Fehlpaarungs-Erfassungsaktivität.

Die Replikation von Bakteriophagen-T4- DNA nach Infektion von E. coli ist ein gut untersuchtes DNA-Replikationssystem. Während des exponentiellen DNA-Anstiegs bei 37 °C beträgt die Elongationsrate 749 Nukleotide pro Sekunde. Die Mutationsrate während der Replikation beträgt 1,7 Mutationen pro 10 ⁸ Basenpaare. Somit ist die DNA-Replikation in diesem System sowohl sehr schnell als auch sehr genau.

Primerentfernung und Nickligation

Es gibt zwei Probleme nach der Synthese von führendem und nachlaufendem Strang: RNA verbleibt im Duplex und es gibt Kerben zwischen jedem Okazaki-Fragment in dem nacheilenden Duplex. Diese Probleme werden durch eine Vielzahl von DNA-Reparaturenzymen gelöst, die je nach Organismus variieren, einschließlich: DNA-Polymerase I, DNA-Polymerase beta, RNAse H, Ligase und DNA2. Dieser Prozess ist bei Prokaryoten gut und bei vielen Eukaryoten viel weniger gut charakterisiert.

Im Allgemeinen vervollständigen DNA-Reparaturenzyme die Okazaki-Fragmente durch eine Vielzahl von Mitteln, einschließlich: Basenpaar-Exzision und 5'-zu-3'-Exonuklease-Aktivität, die die chemisch instabilen Ribonukleotide aus dem nacheilenden Duplex entfernt und sie durch stabile Desoxynukleotide ersetzt. Dieser Prozess wird als „Reifung von Okazaki-Fragmenten“ bezeichnet, und Ligase (siehe unten) vervollständigt den letzten Schritt im Reifungsprozess.

RNA-DNA-Duplex mit Ribonukleotiden, die von einem Priming-Enzym hinzugefügt wurden (-) und Desoxynukleotiden, die von einer replikativen Polymerase (+) hinzugefügt wurden.

=========================================== Zucker-Phosphat-Rückgrat ATCGATATATATGCAGCTAGAAGCTTAAATATATGCTAGCATG Original-Lagerstrang-Basen UAGCUAUAUAUACGTCGATCTTCGAATTTATATACGATCGTAC Mit dem Primer sind neu synthetisierte Basen eine Kombination aus Uracil, Adenin, Thymin, Cytosin und Guanin. =========================================== Beim Primer besteht das Zuckerphosphat-Rückgrat aus Ribose und Desoxyribose. ------------+++++++++++++++++++++++++++++++ - zeigt Ribonukleotid an und + zeigt Desoxynukleotid an

Primer-Entfernung und Nick-Ligation können als DNA-Reparaturprozesse angesehen werden, die einen chemisch stabilen, fehlerfreien Duplex produzieren. In Bezug auf die Chemie eines RNA-DNA-Duplexes neigt zusätzlich zum Vorhandensein von Uracil in dem Duplex die Gegenwart von Ribose (die ein reaktives 2'-OH aufweist) dazu, den Duplex chemisch viel weniger stabil zu machen als eine Duplex, die nur Desoxyribose enthält (die ein nicht-reaktives 2'H aufweist).

DNA-Polymerase I

DNA-Polymerase I ist ein Enzym, das DNA repariert.

RNAse H

RNAse H ist ein Enzym, das RNA aus einem RNA-DNA-Duplex entfernt.

Ligase

Nachdem DNA-Reparaturfaktoren die Ribonukleotide des Primers durch Desoxynukleotide ersetzt haben, verbleibt eine einzelne Lücke im Zucker-Phosphat-Rückgrat zwischen jedem Okazaki-Fragment im nacheilenden Duplex. Ein Enzym namens DNA-Ligase verbindet die Lücke im Rückgrat, indem es zwischen jeder Lücke eine Phosphodiester-Bindung bildet, die die Okazaki-Fragmente trennt. Die strukturellen und chemischen Aspekte dieses Prozesses, der allgemein als „Nick-Translation“ bezeichnet wird, sprengen den Rahmen dieses Artikels.

Eine schematische Ansicht des neuen, nacheilenden DNA-Tochter-Duplexes ist unten zusammen mit dem Zucker-Phosphat-Rückgrat gezeigt.

=========================================== Original nacheilender Strang Desoxyribose-Phosphat-Rückgrat ATCGATATATATGCAGCTAGAAGCTTAAATATATGCTAGCATG Original-Lagerstrang-Basen TAGCTATATATACGTCGATCTTCGAATTTATATACGATCGTAC Nach der Aktivität des DNA-Reparaturfaktors sind die Basen Adenin, Thymin, Cytosin und Guanin. ========|=============|============|======= Nach der Aktivität des DNA-Reparaturfaktors ist das Rückgrat reines Desoxyribose-Phosphat mit Kerben zwischen jedem Okazaki-Fragment.

Die fertige Doppelhaushälfte:
=========================================== Original nacheilender Strang Desoxyribose-Phosphat-Rückgrat ATCGATATATATGCAGCTAGAAGCTTAAATATATGCTAGCATG Original-Lagerstrang-Basen TAGCTATATATACGTCGATCTTCGAATTTATATACGATCGTAC Neu synthetisierte Basen =========================================== Neu synthetisiertes Desoxyribose-Phosphat-Rückgrat ohne Okazaki-Fragmente.

Replikationsstress

Replikationsstress kann zu einer blockierten Replikationsgabel führen. Eine Art von Replikationsstress resultiert aus DNA-Schäden wie Inter-Strang-Crosslinks (ICLs). Eine ICL kann das Fortschreiten der replikativen Gabel aufgrund eines Versagens der DNA-Strangtrennung blockieren. In Wirbeltierzellen löst die Replikation eines ICL-haltigen Chromatin- Templates die Rekrutierung von mehr als 90 DNA-Reparatur- und Genomerhaltungsfaktoren aus . Zu diesen Faktoren gehören Proteine, die sequentielle Einschnitte und homologe Rekombination durchführen .

Geschichte

Katherine Lemon und Alan Grossman zeigten anhand von Bacillus subtilis, dass sich Replisomen nicht wie Züge entlang einer Schiene bewegen, sondern die DNA tatsächlich durch ein stationäres Replisomenpaar an der Zellmembran zugeführt wird. In ihrem Experiment wurden die Replisomen in B. subtilis jeweils mit grün fluoreszierendem Protein markiert, und die Lage des Komplexes wurde in replizierenden Zellen unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie überwacht . Würden sich die Replisomen wie ein Zug auf einer Schiene bewegen, würde sich das Polymerase-GFP-Protein in jeder Zelle an unterschiedlichen Positionen befinden. Stattdessen wurden jedoch in jeder replizierenden Zelle Replisomen als ausgeprägte fluoreszierende Herde beobachtet, die sich in oder nahe der Zellmitte befanden. Zelluläre DNA, die mit einem blauen Fluoreszenzfarbstoff (DAPI) gefärbt wurde, nahm eindeutig den größten Teil des zytoplasmatischen Raums ein.

Verweise

Weiterlesen

Externe Links

• DNA+Replisom der US National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH)