Virales neuronales Tracing - Viral neuronal tracing

Ein PC12-Neuron, das mit dem Pseudorabiesvirus PRV GS443 (grün markiert) infiziert ist. Die vom Zellkörper wegbewegten grünen Punkte demonstrieren den anterograden Transport .

Virales neuronales Tracing ist die Verwendung eines Virus , um neurale Pfade zu verfolgen und einen selbstreplizierenden Tracer bereitzustellen . Viren haben gegenüber molekularen Tracern den Vorteil der Selbstreplikation, können sich aber auch zu schnell ausbreiten und zum Abbau von Nervengewebe führen. Viren, die das Nervensystem infizieren können, sogenannte neurotrope Viren , breiten sich durch Synapsen durch räumlich nahe Anordnungen von Neuronen aus , was ihre Verwendung bei der Untersuchung funktionell verbundener neuronaler Netzwerke ermöglicht. Die Verwendung von Viren zur Markierung funktionell verbundener Neuronen geht auf die Arbeit von Albert Sabin zurück , der einen Bioassay entwickelte, der die Infektion von Viren über Neuronen hinweg beurteilen konnte . Nachfolgende Forschungen ermöglichten die Einbeziehung immunhistochemischer Techniken zur systematischen Markierung neuronaler Verbindungen. Bis heute wurden Viren verwendet, um mehrere Schaltkreise im Nervensystem zu untersuchen.

Geschichte

Die meisten Neuroanatomen würden zustimmen, dass es von größter Bedeutung ist, zu verstehen, wie das Gehirn mit sich selbst und dem Körper verbunden ist. Daher ist es ebenso wichtig, eine Möglichkeit zu haben, die Verbindungen zwischen Neuronen zu visualisieren und zu studieren . Neuronale Tracing-Methoden bieten einen beispiellosen Einblick in die Morphologie und Konnektivität neuronaler Netze. Je nach verwendetem Tracer kann dies auf ein einzelnes Neuron beschränkt sein oder transsynaptisch zu benachbarten Neuronen fortschreiten. Nachdem sich der Tracer ausreichend ausgebreitet hat, kann das Ausmaß entweder durch Fluoreszenz (für Farbstoffe) oder durch Immunhistochemie (für biologische Tracer) gemessen werden . Eine wichtige Innovation auf diesem Gebiet ist die Verwendung neurotroper Viren als Tracer. Diese breiten sich nicht nur über den ursprünglichen Infektionsort aus, sondern können auch über Synapsen springen . Die Verwendung eines Virus stellt einen selbstreplizierenden Tracer bereit. Dies kann die Aufklärung neuronaler Mikroschaltkreise in einem bisher unerreichbaren Ausmaß ermöglichen. Dies hat erhebliche Auswirkungen auf die reale Welt. Wenn wir besser verstehen, welche Teile des Gehirns eng miteinander verbunden sind, können wir die Auswirkungen einer lokalisierten Hirnverletzung vorhersagen. Wenn ein Patient beispielsweise einen Schlaganfall in der Amygdala hat , der hauptsächlich für Emotionen verantwortlich ist , kann der Patient auch Schwierigkeiten haben, bestimmte Aufgaben auszuführen, da die Amygdala stark mit dem orbitofrontalen Kortex verbunden ist , der für das Belohnungslernen verantwortlich ist . Wie immer besteht der erste Schritt zur Lösung eines Problems darin, es vollständig zu verstehen. Wenn wir also eine Hoffnung auf die Behebung einer Hirnverletzung haben möchten, müssen wir zuerst deren Ausmaß und Komplexität verstehen.

Viruslebenszyklus

Der Lebenszyklus von Viren, wie sie beim neuronalen Tracing verwendet werden, unterscheidet sich von denen zellulärer Organismen . Viren sind von Natur aus parasitär und können sich nicht selbst vermehren. Daher müssen sie einen anderen Organismus infizieren und die zelluläre Maschinerie effektiv entführen, um ihren Lebenszyklus zu vervollständigen. Die erste Phase des viralen Lebenszyklus wird als viraler Eintritt bezeichnet . Dies definiert die Art und Weise, wie ein Virus eine neue Wirtszelle infiziert. In der Natur werden neurotrope Viren meist durch Bisse oder Kratzer übertragen, wie das Tollwutvirus oder bestimmte Herpesvirenstämme . In Rückverfolgungsstudien erfolgt dieser Schritt künstlich, typischerweise durch die Verwendung einer Spritze. Die nächste Stufe des viralen Lebenszyklus wird als virale Replikation bezeichnet . Während dieser Phase übernimmt das Virus die Maschinerie der Wirtszelle, um die Zelle zu veranlassen, mehr virale Proteine ​​​​zu bilden und mehr Viren zusammenzusetzen. Sobald die Zelle eine ausreichende Anzahl von Viren hergestellt ist, tritt der Virus die Virusausscheidung Stufe. In dieser Phase verlassen Viren die ursprüngliche Wirtszelle auf der Suche nach einem neuen Wirt. Bei neurotropen Viren erfolgt diese Übertragung typischerweise an der Synapse . Viren können über den relativ kurzen Raum von einem Neuron zum nächsten springen. Diese Eigenschaft macht Viren für Tracer-Studien so nützlich. Sobald das Virus in die nächste Zelle eindringt, beginnt der Zyklus von neuem. Die ursprüngliche Wirtszelle beginnt sich nach dem Ausscheidungsstadium zu zersetzen. In Tracer-Studien ist dies der Grund, warum der Zeitpunkt streng kontrolliert werden muss. Wenn es dem Virus erlaubt wird, sich zu weit auszubreiten, wird die ursprüngliche interessierende Mikroschaltung beeinträchtigt und es können keine nützlichen Informationen abgerufen werden. Typischerweise können Viren nur eine kleine Anzahl von Organismen und selbst dann nur einen bestimmten Zelltyp im Körper infizieren. Die Spezifität eines bestimmten Virus für ein bestimmtes Gewebe wird als Tropismus bezeichnet . Viren in Tracer-Studien sind alle neurotrop (fähig, Neuronen zu infizieren).

Methoden

Infektion

Der virale Tracer kann in periphere Organe wie einen Muskel oder eine Drüse eingeführt werden . Bestimmte Viren, wie z. B. adeno-assoziierte Viren, können in den Blutkreislauf injiziert werden und die Blut-Hirn-Schranke überwinden , um das Gehirn zu infizieren. Es kann auch in ein Ganglion eingeführt oder mit einem stereotaktischen Gerät direkt in das Gehirn injiziert werden . Diese Methoden bieten einzigartige Einblicke in die Zusammenhänge des Gehirns und seiner Peripherie. Viren werden auf viele verschiedene Arten in neuronales Gewebe eingebracht. Es gibt zwei Hauptmethoden, um Tracer in die Zielgewebe einzuführen. Die Druckinjektion erfordert, dass der Tracer in flüssiger Form direkt in die Zelle injiziert wird. Dies ist die gebräuchlichste Methode. Die Iontophorese beinhaltet das Anlegen von Strom an die Tracerlösung innerhalb einer Elektrode. Die Tracermoleküle nehmen eine Ladung auf und werden über das elektrische Feld in die Zelle getrieben. Dies ist eine nützliche Methode, wenn Sie eine Zelle nach der Patch-Clamp- Technik beschriften möchten . Sobald der Tracer in die Zelle eingebracht ist, übernehmen die oben genannten Transportmechanismen. Sobald das Virus in das Nervensystem eingeführt wurde, beginnt es, Zellen im lokalen Bereich zu infizieren. Die Viren funktionieren, indem sie ihr eigenes genetisches Material in das Genom der infizierten Zellen einbauen. Die Wirtszelle produziert dann die von dem Gen kodierten Proteine. Die Forscher sind in der Lage, zahlreiche Gene in die infizierten Neuronen einzubauen, darunter fluoreszierende Proteine, die zur Visualisierung verwendet werden. Weitere Fortschritte beim neuronalen Tracing ermöglichen die gezielte Expression fluoreszierender Proteine ​​in bestimmten Zelltypen.

Histologie und Bildgebung

Hat sich das Virus im gewünschten Ausmaß ausgebreitet, wird das Gehirn in Scheiben geschnitten und auf Objektträger montiert. Dann werden für das Virus spezifische fluoreszierende Antikörper oder fluoreszierende komplementäre DNA- Sonden für virale DNA über die Schnitte gewaschen und unter einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet .

Übertragungsrichtung

Viren können in eine von zwei Richtungen übertragen werden. Zunächst muss man den zugrunde liegenden Mechanismus des axoplasmatischen Transports verstehen . Innerhalb des Axons befinden sich lange, schlanke Proteinkomplexe, die als Mikrotubuli bezeichnet werden . Sie fungieren als Zytoskelett , um der Zelle zu helfen, ihre Form zu erhalten. Diese können auch als Autobahnen innerhalb des Axons fungieren und den Transport von mit Neurotransmittern gefüllten Vesikel und Enzymen zwischen dem Zellkörper oder Soma und dem Axonterminal oder der Synapse hin und her erleichtern . Der Transport kann in beide Richtungen erfolgen: anterograd (von Soma zu Synapse) oder retrograd (von Synapse zu Soma). Neuronen transportieren auf natürliche Weise Proteine , Neurotransmitter und andere Makromoleküle über diese zellulären Wege. Neuronale Tracer, einschließlich Viren, nutzen diese Transportmechanismen, um einen Tracer in einer Zelle zu verteilen. Forscher können damit synaptische Schaltkreise untersuchen.

Anterograder Transport

Anterogrades Tracing ist die Verwendung eines Tracers, der sich von Soma zu Synapse bewegt. Der anterograde Transport verwendet ein Protein namens Kinesin , um Viren entlang des Axons in anterograder Richtung zu bewegen.

Retrograder Transport

Retrogrades Tracing ist die Verwendung eines Tracers, der sich von der Synapse zum Soma bewegt. Beim retrograden Transport wird ein Protein namens Dynein verwendet , um Viren entlang des Axons in retrograder Richtung zu bewegen. Es ist wichtig zu beachten, dass verschiedene Tracer charakteristische Affinitäten für Dynein und Kinesin aufweisen und sich daher mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten ausbreiten.

Doppeltransport

Manchmal ist es wünschenswert, Neuronen stromaufwärts und stromabwärts zu verfolgen, um sowohl die Eingänge als auch die Ausgänge der neuronalen Schaltung zu bestimmen. Dies nutzt eine Kombination der oben genannten Mechanismen.

Vorteile und Nachteile

Die Verwendung von Viren als Tracer hat seine Vor- und Nachteile. Daher gibt es einige Anwendungen, bei denen Viren ein hervorragender Tracer sind, und andere Anwendungen, bei denen es bessere Methoden gibt.

Leistungen

Einer der Vorteile der Verwendung von viralen Tracern ist die Fähigkeit des Virus, über Synapsen zu springen. Dies ermöglicht die Verfolgung von Mikroschaltungen sowie Projektionsstudien. Nur wenige molekulare Tracer sind dazu in der Lage, und solche, die normalerweise ein vermindertes Signal in sekundären Neuronen aufweisen. Daher ist ein weiterer Vorteil der Virusverfolgung die Fähigkeit von Viren, sich selbst zu replizieren. Sobald das sekundäre Neuron infiziert ist, beginnt das Virus, sich zu vermehren und zu replizieren. Es gibt keinen Signalverlust, da sich der Tracer durch das Gehirn ausbreitet.

Nachteile

Obwohl einige Eigenschaften von Viren eine Reihe von Vorteilen bei der Rückverfolgung bieten, bergen andere potenzielle Probleme. Während sie sich durch das Nervensystem ausbreiten, infizieren die viralen Tracer Neuronen und zerstören sie schließlich. Daher muss der Zeitpunkt der Tracer-Studien genau sein, um eine angemessene Ausbreitung zu ermöglichen, bevor der Nerventod eintritt. Die Viren können nicht nur für das Nervengewebe schädlich sein, sondern auch für den gesamten Körper. Daher war es schwierig, für diese Aufgabe perfekt geeignete Viren zu finden. Ein Virus, das zum Aufspüren verwendet wird, sollte idealerweise gerade infektiös genug sein, um gute Ergebnisse zu erzielen, aber nicht so sehr, dass es Nervengewebe zu schnell zerstört oder unnötige Risiken für die Exponierten darstellt. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass das virale neuronale Tracing derzeit den zusätzlichen Schritt erfordert, fluoreszierende Antikörper an die Viren zu binden, um den Weg sichtbar zu machen. Im Gegensatz dazu sind die meisten molekularen Tracer hell gefärbt und können ohne zusätzliche Modifikation mit bloßem Auge betrachtet werden.

Aktuelle Verwendungen

Viral Tracing wird hauptsächlich verwendet, um neuronale Schaltkreise zu verfolgen. Mit einem der zuvor genannten Viren untersuchen Forscher mit sehr feinen Details, wie Neuronen im Gehirn miteinander verbunden sind. Konnektivität bestimmt weitgehend, wie das Gehirn funktioniert. Viren wurden unter anderem verwendet, um retinale Ganglienschaltkreise, kortikale Schaltkreise und spinale Schaltkreise zu untersuchen.

Viren im Einsatz

Im Folgenden finden Sie eine Liste von Viren, die derzeit zum Zweck der neuronalen Verfolgung verwendet werden.

Verweise