Uracil-DNA-Glykosylase - Uracil-DNA glycosylase
Uracil-DNA-Glykosylase , auch bekannt als UNG oder UDG . Seine wichtigste Funktion besteht darin, Mutagenese zu verhindern, indem Uracil aus DNA- Molekülen entfernt wird, indem die N-glykosidische Bindung gespalten und der Basenexzisionsreparaturweg (BER) eingeleitet wird.
Funktion
Das menschliche Gen kodiert für eine von mehreren Uracil-DNA-Glykosylasen. Die alternative Verwendung des Promotors und das Spleißen dieses Gens führt zu zwei verschiedenen Isoformen: der mitochondrialen UNG1 und der nukleären UNG2. Eine wichtige Funktion von Uracil-DNA-Glykosylasen besteht darin, Mutagenese zu verhindern, indem Uracil aus DNA- Molekülen eliminiert wird, indem die N-glykosidische Bindung gespalten und der Basenexzisionsreparaturweg (BER) eingeleitet wird. Uracil- Basen entstehen durch Cytosin- Deaminierung oder Fehleinbau von dUMP- Resten. Nachdem eine Mutation auftritt, breitet sich die mutagene Bedrohung durch Uracil durch alle nachfolgenden DNA-Replikationsschritte aus . Nach dem Entpacken werden nicht übereinstimmende Guanin- und Uracil- Paare getrennt, und die DNA-Polymerase fügt komplementäre Basen ein, um ein Guanin-Cytosin (GC) -Paar in einem Tochterstrang und ein Adenin- Uracil (AU)-Paar in den anderen zu bilden. Die Hälfte aller Nachkommen-DNA, die von der mutierten Matrize stammt, erbt an der Mutationsstelle eine Verschiebung von GC zu AU. UDG schneidet Uracil sowohl in AU- als auch in GU-Paaren heraus, um die Ausbreitung der Basenfehlpaarung zu nachgeschalteten Transkriptions- und Translationsprozessen zu verhindern. Mit hoher Effizienz und Spezifität repariert diese Glykosylase täglich 100–500 beschädigte Basen in der menschlichen Zelle. Menschliche Zellen exprimieren fünf bis sechs Arten von DNA-Glykosylasen , die alle einen gemeinsamen Mechanismus der Baseneversion und Exzision als Mittel zur DNA-Reparatur aufweisen.
Struktur
UDG besteht aus einem viersträngigen parallelen β-Faltblatt, das von acht α-Helices umgeben ist . Das aktive Zentrum umfasst fünf hochkonservierte Motive, die gemeinsam die Spaltung der glycosidischen Bindung katalysieren :
- Wasseraktivierungsschleife: 63-QDPYH-67
- Pro -reiche Schleife: 165-PPPPS-169
- Uracil-bindendes Motiv: 199-GVLLN-204
- Gly - Ser- Schleife: 246-GS-247
- Interkalationsschleife für kleine Rillen : 268-HPSPLS-273
Mechanismus
Die Spaltung der glykosidischen Bindung folgt einem „Pinch-Push-Pull“-Mechanismus unter Verwendung der fünf konservierten Motive.
Pinch : UDG scannt die DNA nach Uracil, indem es unspezifisch an den Strang bindet und einen Knick im Rückgrat erzeugt, wodurch die ausgewählte Base für den Nachweis positioniert wird. Die Pro-reichen und Gly-Ser-Schleifen bilden polare Kontakte mit den 3'- und 5'-Phosphaten, die die untersuchte Base flankieren. Diese Kompression des DNA- Rückgrats oder „Pinch“ ermöglicht einen engen Kontakt zwischen UDG und der interessierenden Base.
Push : Um die Nukleotididentität vollständig zu bestimmen, dringt die Interkalationsschleife in die kleine DNA-Furche ein oder dringt in diese ein und induziert eine Konformationsänderung, um das Nukleotid aus der Helix herauszuklappen. Die Rückgratkompression begünstigt die Eversion des nun extrahelikalen Nukleotids, das für die Erkennung durch das Uracil-bindende Motiv positioniert ist. Die Kopplung von Interkalation und Eversion trägt dazu bei, die Unterbrechung günstiger Basenstapelwechselwirkungen innerhalb der DNA-Helix zu kompensieren. Leu 272 füllt die Lücke, die das umgedrehte Nukleotid hinterlassen hat, um Dispersionswechselwirkungen mit benachbarten Basen zu erzeugen und die Stapelstabilität wiederherzustellen.
Pull : Jetzt für das aktive Zentrum zugänglich, interagiert das Nukleotid mit dem Uracil-Bindungsmotiv. Die Form des aktiven Zentrums ergänzt die umgestülpte Uracil-Struktur und ermöglicht eine hohe Substratspezifität. Purine sind zu groß, um in das aktive Zentrum zu passen, während ungünstige Wechselwirkungen mit anderen Pyrimidinen die Bindung alternativer Substrate verhindern. Die Seitenkette von Tyr 147 interferiert sterisch mit der Thymin- C5- Methylgruppe , während eine spezifische Wasserstoffbrücke zwischen dem Uracil-O2- Carbonyl und Gln 144 gegen ein Cytosin-Substrat diskriminiert, dem das notwendige Carbonyl fehlt. Sobald Uracil erkannt wird, schreitet die Spaltung der glykosidischen Bindung nach dem folgenden Mechanismus fort.
Die Position der Reste, die das Wasser aktivieren Nucleophil und protonieren die Uracil Abgangsgruppe ist weit diskutiert, obwohl der am häufigsten gefolgt Mechanismus das Wasser aktivierende Schleife in der Enzymstruktur detailliert beschäftigt. Unabhängig von der Position sind die Identitäten der Asparaginsäure- und Histidinreste in allen katalytischen Studien konsistent.
Laboreinsatz
Uracil- N- Glykosylase (UNG) ist ein Enzym, das in einer leistungsstarken Methode zur Eliminierung von Verschleppungsprodukten der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in der Real-Time-PCR verwendet wird. Dieses Verfahren modifiziert PCR-Produkte so, dass in einer neuen Reaktion alle Restprodukte aus früheren PCR-Amplifikationen verdaut und an der Amplifikation gehindert werden, die wahren DNA-Matrizen jedoch nicht beeinflusst werden. Die PCR synthetisiert jede Runde reichlich Amplifikationsprodukte, aber die Kontamination weiterer PCR-Runden mit Spurenmengen dieser Produkte, die als Verschleppungskontamination bezeichnet wird, führt zu falsch positiven Ergebnissen. Verschleppungskontaminationen aus einigen früheren PCRs können ein erhebliches Problem darstellen, sowohl aufgrund der Fülle an PCR-Produkten als auch aufgrund der idealen Struktur des verunreinigenden Materials für die Reamplifikation. Die Kontamination durch Verschleppung kann jedoch durch die folgenden zwei Schritte kontrolliert werden: (i) Einbau von dUTP in alle PCR-Produkte (durch Ersetzen von dUTP für dTTP oder durch Einbau von Uracil während der Synthese von Primern; und (ii) Behandeln aller nachfolgenden vollständig vormontierten Startreaktionen mit Uracil-DNA-Glycosylase (UDG), gefolgt von einer thermischen Inaktivierung von UDG. UDG spaltet die Uracil-Base vom Phosphodiester-Rückgrat der Uracil-enthaltenden DNA ab, hat jedoch keine Wirkung auf natürliche (dh Thymin-enthaltende) DNA. Die resultierenden apyrimidinischen Stellen blockieren Replikation durch DNA-Polymerasen und sind sehr labil gegenüber Säure/Base-Hydrolyse.Da UDG nicht mit dTTP reagiert und auch vor der eigentlichen PCR durch Hitzedenaturierung inaktiviert wird, kann die Kontamination von PCRs durch Verschleppung effektiv kontrolliert werden, wenn die Verunreinigungen enthalten Uracile anstelle von Thyminen.
Uracil- N- Glykosylase wurde auch in einer Studie verwendet, um Beweise für eine anhaltende niedrige Stoffwechselaktivität und DNA-Reparatur in alten Bakterien nachzuweisen . Ein langfristiges Überleben von Bakterien kann entweder durch Endosporenbildung (bei der das Bakterium in eine totale Ruhephase eintritt, ohne dass eine Stoffwechselaktivität stattfindet und somit keine DNA-Reparatur stattfindet) oder aber durch eine Reduzierung der Stoffwechselaktivität auf ein sehr niedriges Niveau erfolgen Geschwindigkeit, gerade ausreichend, um eine laufende DNA-Reparatur durchzuführen und die Erschöpfung anderer instabiler Moleküle (wie ATP ) zu verhindern, wobei die Mikrobe in der Lage ist, Schäden an ihrer DNA zu reparieren, aber auch weiterhin langsam Nährstoffe verbraucht. DNA-Sequenzen von Bakterien im Permafrost wurden mittels PCR amplifiziert. Eine Serie von Durchläufen amplifizierte die DNA-Sequenzen unverändert (um die gesamte lebende bakterielle DNA in den Proben nachzuweisen), während die andere Serie spezifisch nach DNA suchte, die einer laufenden Reparatur unterzogen wurde; dazu wurde die DNA mit UNG behandelt, um Uracile zu entfernen. Dies verhinderte die Amplifikation unreparierter DNA in zweierlei Hinsicht: Erstens verhinderten die abasischen Stellen, die durch die Entfernung von Uracilen erzeugt wurden, dass die in der PCR verwendete DNA-Polymerase die Schadensstelle passierte, während diese abasischen Stellen die DNA auch direkt schwächten und wahrscheinlicher machten beim Erhitzen zersplittern. Auf diese Weise konnten die Forscher Beweise für eine laufende DNA-Reparatur in Gram-positiven Bakterien mit hohem GC bis zu einem Alter von 600.000 Jahren nachweisen.
Uracil-N-Glycosylase wurde auch in einem Verfahren zum Klonieren von PCR-amplifizierten DNA-Fragmenten verwendet. Bei diesem Verfahren werden die in der PCR verwendeten Primer mit Uracilresten anstelle von Thymin synthetisiert. Wenn diese Primer in PCR-amplifizierte Fragmente eingebaut werden, wird die Primersequenz für den Verdau mit Uracil N Glycosylase empfänglich und erzeugt 3'-überstehende Enden, die an eine entsprechend präparierte Vektor-DNA angelagert werden können. Die resultierenden chimären Moleküle können mit hoher Effizienz in kompetente Zellen umgewandelt werden, ohne dass eine in vitro-Ligation erforderlich ist.
Interaktionen
Es wurde gezeigt, dass Uracil-DNA-Glycosylase mit RPA2 interagiert .
